Fertiliser Control 11th Amendment Order,2025

रजिस्ट्री स.ं डी.एल.- 33004/99 REGD. No. D. L.-33004/99 सी.जी.-डी.एल.-अ.-06102025-266713 CG-DxLx-xEG-I0D6H1x0x2x0 25-266713 xxxGIDExxx असाधारण EXTRAORDINARY भाग II—खण् ड 3—उप-खण्ड (ii) PART II—Section 3—Sub-section (ii) प्राजधकार स ेप्रकाजित PUBLISHED BY AUTHORITY स.ं 4405] नई कदल्ली, सोमवार, अक्त बू र 6, 2025/आज‍व न 14, 1947 No. 4405] NEW DELHI, MONDAY, OCTOBER 6, 2025/ASVINA 14, 1947 कृजि एव ं ककसान कल्याण मत्रं ालय (कृजि एव ं ककसान कल्याण जवभाग) आदिे नई कदल्ली, 30 जसतम् बर, 2025 का. आ. 4533(अ).— के न्द्रीय सरकार, आवश्यक वस्तु अधिधियम, 1955 (1955 का 10) की िारा 3 द्वारा प्रदत्त शक्तिय ों का प्रय ग करते हुए उववरक (अकार्वधिक, कार्वधिक या धमधित) (धियोंत्रण) आदेश, 1985 का और सोंश िि करिे के धिए धिम्नधिक्तित आदेश करती है, अर्ावत:-

1. (1) इस आदेश का सोंधिप्त िाम उववरक (अकार्वधिक, कार्वधिक या धमधित) (धियोंत्रण) ग्यारहवााँ सोंश िि आदेश, 2025 है।

(2) यह राजपत्र में प्रकाशि की तारीि से प्रवृत्त ह गा।

2. उववरक (अकार्वधिक, कार्वधिक या धमधित) (धियोंत्रण) आदेश, 1985 में, अिुसूची VI में, भाग घ “परीिण की कायवपद्धधत” में, उपशीर्वक 32, “आसेधिक का अविारण” के पश्चात्, धिम्नधिक्तित मदें और प्रधवधियाों रिी जाएोंगी, अर्ावत:- 6671 GI/2025 (1)2 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] “33. एचपीएलसी द्वारा सैलललसललक एलसड का अवधारण -

33.1 उपकरण- (क) ररवसव फे ज़ सी-18 कॉिम (250 धममी × 4.6 धममी x 5 माइक् िों ) (ख) यूवी धिटेक्टर (ग) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस (घ) 0.22 माइक् िों धसररोंज ध़िल्टर

33.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) एसीट धिटराइि (एचपीएिसी ग्रेि, सीएएस िों. 75-05-8) (ि) ऑर्ोफॉस्फ ररक एधसि (सीएएस िों. 7664-38-2) (ग) सैधिधसधिक एधसि (सीएएस िों. 69-72-7) (घ) जि (एचपीएिसी ग्रेि) (ङ) म र्ाइि फे ज की तैयारी: एसीट धिटराइि और जि (0.1% ऑर्ोफॉस्फ ररक एधसि के सार्) क 50:50 वी/वी के अिुपात में िें, इसे 5 धमिट के धिए स धिके ट करें और उपय ग से पहिे धवियि क वैक्यूम ध़िल्टर करें और िीगैस करें। (च) सैधिधसधिक एधसि मािक के स्टॉक धवियि की तैयारी: 10 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में सैधिधसधिक एधसि (10 धमिीग्राम) िें, फ्लास्क में 7 धमिी िीटर म र्ाइि फे ज िािें, 10 धमिट तक स धिके ट करें, म र्ाइि फे ज के सार् आयति 10 धमिी िीटर करें, इस प्रधक्या से 1000 पीपीएम का स्टॉक धवियि प्राप्त ह ता है। (छ) सैधिधसधिक एधसि के कायवशीि धवियि की तैयारी: 1.0 धमिी िीटर स्टॉक मािक क म र्ाइि फे ज के सार् 10 धमिी िीटर तक तिु करें और अच्छी तरह धमिाएाँ, इससे 100 पीपीएम का कायवशीि मािक धवियि प्राप्त ह ता है, 1.0 धमिी िीटर कायवशीि मािक धवियि क म र्ाइि फे ज के सार् 10 धमिी िीटर तक पतिा करें, इससे 10 पीपीएम का प्राय धगक मािक धवियि प्राप्त ह ता है, धिम्न ताधिका यर्ाधवधिधदवि कै धिब्रेशि वक् तैयार करें:- ताललका क्.सों. रैक्तिकता स्टॉक धवियि उपय ग धकए प्रय ग धकए जािे मािक की मािक की साोंद्रता जािे वािे स्टॉक वािे जि का साोंद्रता (माइक् (पीपीएम) धवियि का आयति (धम. ग्राम/धम. िी.) आयति (धम. िी.) िी.)

(i) मािक 1 10 पीपीएम 0.10 0.90 1

(ii) मािक 2 10 पीपीएम 0.50 0.50 5

(iii) मािक 3 10 पीपीएम 1.0 0.00 10

(iv) मािक 4 100 पीपीएम 0.25 0.75 25

(v) मािक 5 100 पीपीएम 0.50 0.50 50

(vi) मािक 6 100 पीपीएम 1.0 0.00 100 (ज) िमूिा धवियि की तैयारी:-

(i) िमूिा िेिे से पहिे उत्पाद क अच्छी तरह धमिाएों या धहिाएों;

(ii) तरि उत्पाद ों के धिए, 50 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में उत्पाद का 0.5 से 5 ग्राम (±10%) सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम 0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;

(iii) पाउिर उत्पाद ों के धिए, धजिके पुिगवठि की आवश्यकता िही ोंहै, 50 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में

1.0 ग्राम पाउिर का सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम 0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 3

(iv) 50 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में िगभग 10 से 15 धमिी म र्ाइि फे ज़ िािें और पाउिर क पूणव रूप से घुििे तक घुमाएों या धहिाएों; पाउिर उत्पाद ोंके धिए ज उप-ग्राम स्तर पर सजातीय िही ों हैं, उत्पाद िेर्ि अिुदेश ों का पािि करते हुए पुिगवधठत करें और 50 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 1.0 ग्राम पुिगवधठत उत्पाद का सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम 0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;

(v) म र्ाइि फे ज़ के सार् आयति क 50 धमिी िीटर तक र्िाएों;

(vi) इसे तीस धमिट तक स धिके ट करें और 0.22माइक् िों धसररोंज धफल्टर से छाि िें; और

(vii) धवश्लेर्ण के धिए एचपीएिसी-यूवी धसस्टम में 10 माइक् िीटर इोंजेक्ट करें।

33.3 प्रलिया- धिम्न ताधिका में यर्ाधिधदवि एचपीएिसी क्तथर्धतय ोंका पािि करते हुए धवश्लेर्ण करें- ताललका

(i) कॉिम सी-18 (250 धमिी मीटर x 4.6 धमिी मीटर x 5 माइक् िों )

(ii) धिटेक्टर यूवी

(iii) धिटेक्टर वेविेंर् 237 िैि मीटर

(iv) प्रवाह दर 1.0 धमिी िीटर/धमिट

(v) कॉिम तापमाि 40 धिग्री सेक्तियस

(vi) म र्ाइि फे ज एसीट धिटराइि का उपय ग करके म र्ाइि फे ज के सार् आइस क्े धटक धििािि: 0.1% ऑर्ोफॉस्फ ररक एधसि के सार् जि (50: 50 वी/वी)

(vii) रि टाइम 50 धमिट

(viii) इिजेक्शि आयति 10 माइक् िीटर

33.4 संगणना- िमूिा िेत्रफि x मािक साोंद्रता x धवियि सैधिधसधिक एधसि (धमिी ग्राम/धकि ग्राम) = मािक िेत्रफि x िमूिा वजि

33.5 संदिम- क वाल्स्स्का एम, व क्तनियाक एम, धकजेक एम, धमटर ज़ पी, थज़ाकीि जे, ट्यूरेक पी. एक िए दवा उत्पाद में एधसटाइिसैधिधसधिक एधसि की अशुक्तद्धय ों के अविारण के धिए एचपीएिसी पद्धधत का सत्यापि प्रर्ोंिि, साइोंधटधफक ररप ट्वस 2022 जिवरी 6;12 (1):1।

34. एचपीएलसी द्वारा साइटोकाइलनन का अवधारण -

34.1 उपकरण- (क) ररवसव फे ज़ सी-18 कॉिम (250 धममी × 4.6 धममी x 5 माइक् िों ) (ख) यूवी धिटेक्टर (ग) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस (घ) 0.22 माइक् िों धसररोंज ध़िल्टर

34.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) एसीट धिटराइि (एचपीएिसी ग्रेि, सीएएस िों. 75-05-8) (ख) जि (एचपीएिसी ग्रेि) (ग) मेर्िॉि (एचपीएिसी ग्रेि, सीएएस ि. 67-56-1) (घ) म र्ाइि फे ज की तैयारी.-4 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] सॉिवेंट ए - मेर्िॉि: जि: ग्लेधशयि एधसधटक एधसि (50:450:1, वी/वी/वी); और सॉिवेंट र्ी - मेर्िॉि: ग्लेधशयि एधसधटक एधसि (500: 1, वी/वी) (ङ) धजएधटि के मािक स्टॉक धवियि की तैयारी: 10 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 10 धमिीग्राम धजएधटि िें, इसमें 1 धमिी िीटर 0.1N स धियम हाइिर क्साइि धमिाएों और स धिके शि से घ िें, मेर्िॉि का उपय ग करके आयति 10 धमिी िीटर तक र्िाएों, इससे 1000 पीपीएम का स्टॉक धवियि प्राप्त ह ता है। (च) धजएधटि के कायवशीि धवियि की तैयारी :1.0 धमिी स्टॉक मािक क मेर्िॉि के सार् 10 धमिी तक तिु करें और अच्छी तरह से धमिाएों, यह 100 पीपीएम का एक मध्यवती मािक धवियि देता है, म र्ाइि फे ज के सार् 1.0 धमिी मध्यवती मािक धवियि क 10 धमिी तक तिु करें, यह 10 पीपीएम का एक मध्यवती मािक धवियि देता है, धिम्न ताधिका में यर्ाधिधदवि धववरण ोंके अिुसार कै धिब्रेशि वक् तैयार करें:- ताललका क्.सों. रैक्तिकता स्टॉक धवियि प्रय ग धकए जािे प्रय ग धकए मािक की साोंद्रता मािक की साोंद्रता वािे स्टॉक जािे वािे (माइक् ग्राम/धमिी (पीपीएम) धवियि का मेर्िॉि का िीटर) आयति (धमिी आयति िीटर) (धमिी िीटर)

(i) मािक 1 10 पीपीएम 0.50 0.50 5

(ii) मािक 2 10 पीपीएम 1.0 0.00 10

(iii) मािक 3 100 पीपीएम 0.5 0.50 50

(iv) मािक 4 100 पीपीएम 1.0 0.00 100

(v) मािक 5 1000 पीपीएम 0.2 0.80 200

(vi) मािक 6 100 पीपीएम 0.4 0.60 400 (छ) िमूिा धवियि की तैयारी-

(i) िमूिा िेिे से पहिे उत्पाद क अच्छी तरह धमिाएों या धहिाएों;

(ii) तरि उत्पाद के धिए, 50 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में उत्पाद का 0.5 से 5 ग्राम (±10%) सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम 0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;

(iii) पाउिर उत्पाद, धजन्हें पुिगवठि की आवश्यकता िही ोंहै, 50 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 1.0 ग्राम पाउिर सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम 0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;

(iv) 50 धमिी िीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में िगभग 10 से 15 धमिी म र्ाइि फे ज़ िािें और पाउिर क पूरी तरह से घुििे तक घुमाएों या धहिाएों; पाउिर उत्पाद ों के धिए ज उप-ग्राम स्तर पर सजातीय िही ों हैं, उत्पाद िेर्ि अिुदेश ों का पािि करते हुए पुिगवधठत करें और 50 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 1.0 ग्राम पुिगवधठत उत्पाद का सटीक वजि िें और वजि क धिकटतम

0.0001 ग्राम तक ररकॉिव करें;

(v) म र्ाइि फे ज़ के सार् आयति क 50 धमिी िीटर तक र्िाएाँ;

(vi) इसे तीस धमिट तक स धिके ट करें और 0.22माइक् िों धसररोंज धफल्टर से छाि िें; और

(vii) धवश्लेर्ण के धिए एचपीएिसी-यूवी प्रणािी में 10माइक् िीटर इोंजेक्ट करें।

34.3 प्रलिया- (क) प्रारोंभ में कॉिम क 80% सॉिवेंट ए और 20% सॉिवेंट र्ी के धमिण के सार् अिुकू धित करें, यौधगक ों (कम्पाउन्ड्स) क एचपीएिसी क्तथर्धतय ों में धदए गए सॉिवेंट प्रणािी का उपय ग करके[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 5 मेर्िॉि साोंद्रता क शून्य से र्ीस धमिट (20% र्ी+ 80% ए) से (45% र्ी+ 55% ए), र्ीस से र्ाईस धमिट (45% र्ी + 55% ए), र्ाईस से तीस धमिट (45% र्ी + 55% ए) से (60% र्ी + 40% ए), तीस से चािीस धमिट (60% र्ी से 40% ए) तक र्ढािे के ग्रेधिएोंट एल्यूशि के सार् धििािि करें; और (ि) एचपीएिसी क्तथर्धतयाों: धिम्न ताधिका में यर्ाधिधदवि एचपीएिसी प्रचािि क्तथर्धतय ों का पािि करते हुए एचपीएिसी धवश्लेर्ण करें:

ताललका

(i) कॉिम सी18 (250 धमिी मीटर x 4.6 धमिी मीटर x 5 माइक् िों )

(ii) धिटेक्टर यूवी

(iii) धिटेक्ट करिे के धिए वेविेंर् 269 िैि मीटर

(iv) प्रवाह दर 0.5 धमिी िीटर/धमिट

(v) कॉिम तापमाि 30 धिग्री सेक्तियस

(vi) म र्ाइि फे ज धविायक A- मेर्िॉि: जि: ग्लेधशयि एधसधटक अम्ल (50:450: l, वी /वी /वी ) धविायक B- मेर्िॉि: ग्लेधशयि एधसधटक एधसि (500: 1, वी /वी)

(vii) रि टाइम 40 धमिट

(viii) इिजेक्शि आयति 20 माइक् िीटर

34.4 गणना- िमूिा िेत्रफि x मािक साोंद्रता x धवियि साइट धकधिि (धमिी ग्राम/धकि ग्राम) = मािक िेत्रफि x िमूिा वजि

34.5 संदिम- क्यूई, र्ी.; वू, सी.; धियाोंग, एच.; कु ई, के .; फहद, एस.; वाोंग, एम.; धियू, र्ी.; िी, एि.; हुआोंग, जे.; टैंग, एच. िौ साइट काइधिि, इोंि ि-3-एधसधटक एधसि और एक्तिधसक एधसि के अविारण के धिए अिुकू धित उच्च-प्रदशवि तरि क् मैट ग्राफी पद्धधत। सस्टेिेधर्धिटी 2021, 13, 6998 ।

35. कार्बोहाइडरेट या सैकराइड्स का अवधारण -

35.1 उपकरण- (क) स्पेक्टर फ ट मीटर (ि) व टेक्स धमक्सर (ग) हीधटोंग मेंटि/वाटर र्ार् (घ) र्ैिेंस

35.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) एोंथ्र ि (सीएएस ि. 90-44-8) (ि) सान्द्र हाइिर क्ल ररक एधसि (सीएएस ि. 7647-01-0) (ग) सान्द्र सल्स्यूररक एधसि (सीएएस ि. 7664-93-9) (घ) 2.5N हाइिर क्ल राइि: 208.3 धमिीिीटर साोंद्र हाइिर क्ल ररक एधसि िें और जि के सार् 1000 धमिी िीटर तक आयति पूरा करें। (ङ) एोंथ्र ि अधभकमवक: 200 धमिीग्राम एोंथ्र ि क 100 धमिीिीटर आइस-क ल्ड साोंद्र सल्स्यूररक एधसि में घ िें, उपय ग से पहिे ताज़ा तैयार करें।6 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] (च) मािक ग्लूक ज़ स्टॉक : 100 धमिीग्राम ग्लूक ज़ क 100 धमिीिीटर जि में घ िें, इससे 1000 धमिीग्राम/धमिी ग्लूक ज़ धवियि तैयार ह ता है। (छ) कायवशीि मािक: आसुत जि के सार् 10 धमिी िीटर ग्लूक ज़ स्टॉक धवियि क 100 धमिी िीटर तक तिु करें, यह 100 धमिी ग्राम/धमिी िीटर का कायवशीि मािक देता है, ट ल्यूि की कु छ र्ूोंदें िाििे के र्ाद इसे रेधिजरेट करके रिें। लटप्पण : आइस-क ल्ड एोंथ्र ि अधभकमवक िाििे से पहिे सभी ट्यूर् ोंकी सामग्री क र्फव पर ठोंिा कर िें।

35.3 प्रलिया- (क) 100 धमिी ग्राम सैंपि क उर्िते ट्यूर् में तौिें; (ि) इसे 5 धमिी िीटर 2.5एि हाइिर क्ल ररक एधसि के सार् उर्िते वाटरर्ार् में 3 घोंटे तक रिकर हाइिर िाइज़ करें और कमरे के तापमाि तक ठोंिा करें;

(ग) र्ुदर्ुदाहट र्ोंद ह िे तक ठ स स धियम कार्ोिेट के सार् इसे उदासीि करें; (घ) आयति क 100 धमिीिीटर तक र्िाएों और सेंटरीयूग करें; (ङ) सतह पर तैरिे वािा पदार्व एकत्र करें और धवश्लेर्ण के धिए 0.5 धमिीिीटर और 1 धमिीिीटर अोंश िें;

(च) कायवशीि मािक के 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 और 1 धमिी िीटर िेकर मािक तैयार करें, '0' शून्य क दशावता है। (छ) आसुत जि िािकर िमूिा ट्यूर् सधहत सभी ट्यूि में आयति क 1 धमिी िीटर तक र्िाएों; (ज) 4 धमिी िीटर आइस-क ल्ड एोंथ्र ि अधभकमवक धमिाएों;

(झ) उर्िते जि में आठ धमिट तक गमव करें; (ञ) र्फव पर तेजी से ठोंिा करें और 630 िैि मीटर पर पर हरा से गहरा हरा रोंग ह िे तक रीधिोंग िें; (ट) एक्स-अि पर मािक साोंद्रता र्िाम वाई-अि पर अवश र्ण क आिेक्तित करके एक मािक ग्राफ र्िाएों; और (ठ) ग्राफ से सैंपि ट्यूर् में धवद्यमाि कार्ोहाइिरेट की मात्रा की सोंगणिा करें।

35.4 गणना- कार्ोहाइिरेट की मात्रा = (ग्लूक स का धमिी ग्राम ÷ पररिण िमूिे का आयति) x 100 (100 धमिी ग्राम िमुिे में)

35.5 संदिम- हेज, जेई और ह िे इटर र्ीटी (1962) इि: कार्ोहाइिरेट के धमस्टरी 17 (सोंपादक क्तिस्लर आर एि और र्ी धमिर, जे एि) अकादधमक प्रेस न्यूयॉकव ।

36. स्टाचम का अवधारण.-

36.1 उपकरण- (क) वाटर र्ार् (ि) हाई स्पीि सेंधटरयूग (ग) स्पेक्टर फ ट मीटर (घ) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 7

36.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) इर्ेिॉि 95%- 95 धमिी िीटर शुद्ध इर्ेिॉि में 5 धमिी िीटर जि धमिाएों (ि) सान्द्र परक्ल ररक एधसि (ग) सान्द्र सल्स्यूररक एधसि

36.3 प्रलिया- (क) शुगर क हटािे के धिए िमूिे के 0.1 से 0.5 ग्राम क गमव 80% इर्ेिॉि में समरूधपत करें, सेंधटरयूग करें और अवशेर् क र ककर रिें, अवशेर् क गमव 80% इर्ेिॉि से र्ार-र्ार तर् तक ि एाँ जर् तक धक ि िे पर एोंथ्र ि अधभकमवक से रोंग ि आ जाए, अवशेर् क वाटर र्ार् में अच्छी तरह सुिाएाँ;

(ि) अवशेर् में 5.0 धमिी िीटर जि और 6.5 धमिी िीटर 52% परक्ल ररक एधसि धमिाएों; (ग) 0 धिग्री सेक्तियस पर 20 धमिट तक धिष्कर्वण करें, सेंधटरयूग करें और सतह पर तैरिे वािे पदार्व क सुरधित रिें; (घ) ताज़ा परक्ल ररक एधसि का उपय ग करके धिष्कर्वण (एक्सटरैक्शि) द हराएों, सेंधटरयूग करें और सतह पर तैरिे वािे पदार्व क जमा करें और 100 धमिी िीटर तक तैयार करें;

(ङ) सतह पर तैरिे वािे पदार्व के 0.1 धमिीिीटर या 0.2 धमिीिीटर क धपपेट से र्ाहर धिकािें और जि के सार् आयति क 1 धमिी िीटर तक र्िाएाँ; और (च) एोंथ्र ि अधभकमवक का उपय ग करके अपचायक शकव रा के धवश्लेर्ण के धिए आगे र्ढें, जैसा धक उप- शीर्वक 35 में कार्ोहाइिरेट या सैकराइि के अविारण में वधणवत है।

36.4 संगणना- मािक ग्राफ का उपय ग करके िमूिे में ग्लूक ज की मात्रा ज्ञात करें, स्टाचव की मात्रा ज्ञात करिे के धिए माि क 0.9 से गुणा करें।

36.5 संदिम- हॉज जेई और ह िे इटर र्ीटी 1962. इि: मेर्ि्स इि कार्ोहाइिरेट के धमस्टरी (सोंपादक क्तिस्लर आरएि और र्ी धमिर जेएि) एके िधमक प्रेस न्यूयॉकव ।

37. सेल्यूलेज कयमलाप का अवधारण -

37.1 उपकरण- (क) स्पेक्टर फ ट मीटर (ि) वाटर र्ार् (ग) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस

37.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) कार्ोक्सी धमर्ाइि सेिुि ज़ (सीएएस ि. 9004-32-4) (ि) िाइिाइटर सैधिसाइक्तक्लक एधसि (सीएएस ि. 609-99-4) (ग) धफि ि (सीएएस ि. 108-95-2) (घ) स धियम सल्फाइट (सीएएस ि. 7757-83-7) (ङ) र शेि सॉल्ट (प टेधशयम स धियम टाटावरेट) (सीएएस ि. 6381-59-5) (च) साइधटरक एधसि म ि हाइिरेट (सीएएस ि. 5949-29-1) (छ) साइटरेट र्फर: 750 धमिी िीटर आसुत जि में साइधटरक एधसि म ि हाइिरेट (210 ग्राम) घ िें, स धियम हाइिरॉक्साइि का उपय ग करके पीएच क 4.3 पर समाय धजत करें, आयति क 1000 धमिीिीटर र्िाएों और पीएच क 4.5 पर समाय धजत करिे के धिए स धियम हाइिरॉक्साइि िािें, यह 1एम साइटरेट र्फर (पीएच 4.5) देता है, अर् 1एम साइटरेट र्फर का 5 धमिी िीटर िें, 90 धमिीिीटर धिक्तस्टल्ड जि धमिाएाँ और स धियम हाइिरॉक्साइि का उपय ग करके पीएच क 4.88 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] पर समाय धजत करें, आसुत जि के सार् आयति क 100 धमिीिीटर करें, यह 0.05एम साइटरेट र्फर (पीएच 4.8) का धवियि देता है। (ज) िाइिाइटर सैधिधसधिक एधसि (िीएिएसए) स्टॉक धवियि: इसमें धवियि ए और धवियि र्ी सक्तिधित हैं जैसा धक िीचे धदया गया है-

(i) धवियि ए: 1000 धमिीिीटर जि में 10 ग्राम स धियम हाइिरॉक्साइि घ िें, अच्छी तरह से धमिाएों और इससे 1% स धियम हाइिरॉक्साइि धवियि प्राप्त ह गा; और

(ii) धवियि र्ी: धवियि ए में 200 धमिीग्राम प टेशीयम-स धियम टाटावरेट, 2 ग्राम धक्स्टिीय धफि ि और 10 ग्राम िीएिएस धमिाएों, र्ीकर क हीटर/क्तस्टरर पर रिें और िीरे-िीरे गमव करें, धहिाते हुए, घुििे तक, कमरे के तापमाि तक ठोंिा करें और धवियि क 4°से. पर एम्बर रोंग की र् ति ोंमें सोंग्रधहत करें। (झ) िीएिएसए. कायवशीि धवियि: 99 धमिी स्टॉक िीएिएसए में 1 धमिी 5% स धियम सल्फाइट िािें और अच्छी तरह धमिाएों;

(ञ) सिटरेट तैयार करिा: 2 ग्राम कार्ोक्तक्सधमर्ाइि सेिुि ज (सीएमसी) तौिें और इसे 100 धमिी

0.05एम साइटरेट र्फर (पीएच 4.8) में घ िें, अच्छी तरह धवियि र्िािे के धिए धमिण क अच्छी तरह धहिाएों और यधद आवश्यक ह , त घुििे में आसािी के धिए धवियि क मध्यम तापमाि (जैसे, 60 °से.) तक गमव करें; (ट) ग्लूक ज मािक स्टॉक धवियि: 100 धमिी जि में 100 धमिीग्राम ग्लूक ज घ िें और यह 1 धमिीग्राम/धमिी का स्टॉक देता है;

(ठ) ग्लूक ज का कायवशीि मािक धवियि: एक साफ सूिी परिििी में 0.1 धमिी से 1 धमिी तक धपपेट से धिकािें, 0.05 एम साइटरेट र्फर (पीएच 4.8) के सार् आयति 1 धमिी तक करें और 1 धमिी 0.05एम साइटरेट र्फर (pH 4.8) िेकर ब्लेंक तैयार करें; और (ि) िमूिा धवियि की तैयारी: िमूिा िेिे से पहिे उत्पाद क अच्छी तरह धमिाएों या धहिाएों, तरि उत्पाद के धिए, िमूिे का 1 धमिी िें और 0.05एम साइटरेट र्फर (pH 4.8) क धमिाकर तिु करें और सोंगणिा के धिए तिुकरण कारक का उपय ग करें और पाउिर उत्पाद के धिए, 1 ग्राम िमूिा िें और इसे 10 धमिी 0.05एम साइटरेट र्फर (पीएच 4.8) में घ िें और परीिण के धिए इस िमूिे का 1 धमिी िें।

37.3 प्रलिया- (क) परिििी में 1 धमिीिीटर परीिण िमूिा, ब्लेंक और ग्लूक ज कायवशीि मािक िें और 50 °से. पर तैयार वॉटर र्ार् में तीस धमिट के धिए इिक्यूर्ेट करें; (ि) 3 धमिीिीटर िीएिएसए अधभकमवक िािें और परिििी क उर्िते वॉटर र्ार् में पोंद्रह धमिट के धिए इिक्यूर्ेट करें; और (ग) िमूि ोंक ठोंिा करें और स्पेक्टर फ ट मीटर में 575 एिएम पर अवश र्ण पढें।

37.4 संगणना- (क) ग्लूक ज का मािक कवव तैयार करें तर्ा िमूि ों में अपचायक शकव रा के प्रकिि के धिए अशाकि करें; और (ख) समीकरण का उपय ग करके एोंजाइम कयविाप क आईयू/एमएि के रूप में व्यि करें- सीएमके स कयविाप = ग्लूक ज ररिीज (धमिीग्राम) x 0.37 x िीए़ि (यधद क ई ह त )

37.5 संदिम- घ र् टीके 1987. सेल्यूिेज कयविाप का मापि. शुद्ध और अिुप्रयुि रसायि धवज्ञाि 59: 257-268.[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 9

38. लवकरहार्ो र्ाइसेसानोर्ोलस की गणना का अवधारण -

38.1 उपकरण- (क) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस (ख) पीएच मीटर (ग) आट क्लेव। (घ) जैव सुरिा कै धर्िेट या िेधमिार एयर फ्ल चेम्बर (ङ) इिक्यूर्ेटर (च) कॉि िी काउोंटर

38.2 ग्रोथ र्ीलडयर् और डाइल्यूऐटं की तैयारी - (क) ग्र र् मीधियम: धिम्न ताधिका में धवधिधदवि सोंरचिा के अिुसार र ज र्ोंगाि अगर मीधिया तैयार करें ताललका क्. सों. सोंघटक ग्राम प्रधत िीटर

(i) िेक्सटर ज़ 10

(ii) पेप्ट ि 5

(iii) म ि प टेधशयम फॉस्फे ट 1

(iv) मैग्नीधशयम सल्फे ट 0.5

(v) र ज र्ोंगाि 0.05

(vi) अगर 18

(vii) पीएच 7.2± 0.2 (ि) तैयार धकए गए मीधिया क 121°से. पर 15 धमिट के धिए ऑट क्लेव करें, 10 धमिी ध़िल्टर से धवसोंक्ाधमत क्ल र टेटरासाइक्तक्लि या क्ल रैमफे धिकॉि (1% भार /आयति) धमिाएों; (ग) िाइिूएोंट : धफधजय िॉधजकि सिाइि (0.9% स धियम क्ल राइि) —0.9 ग्राम स धियम क्ल राइि क 100 धमिीिीटर जि में धमिाएों।

38.3 प्रलिया- (क) क्. सों. 38.2 में वधणवत सोंघटि और प्रधक्या के अिुसार र ज र्ोंगाि अगर मीधिया तैयार करें और इसे 45–50 °से. तक ठोंिा ह िे दें। (ि) िैधमिार फ्ल र्ेंच पर प्रत्येक पेटरी प्लेट में िगभग 15–20 धमिीिीटर मीधिया िािें, (ग) परीिण िमूिे की 10 ग्राम मात्रा क 250 धमिीिीटर क धिकि फ्लास्क में 90 धमिीिीटर ऑट क्लेव धकए गए धफधजय िॉधजकि सिाइि के सार् धमिाएों, इसे शेकर पर 150 आरपीएम पर 30 धमिट तक धहिाएों। इससे 10⁻¹ धवियि प्राप्त ह ता है। (घ) िौ ट्यूर्ें तैयार करें, धजसमें प्रत्येक में धफधजय िॉधजकि सिाइि ह , इन्हें ऑट क्लेव करके ठोंिा करें, 10⁻¹ धवियि से 1 धमिीिीटर भाग धिकािकर 9 धमिीिीटर धफधजय िॉधजकि सिाइि वािी अगिी ट्यूर् में िािें, इससे 10⁻² धवियि र्िता है। इसी प्रकार, प्रत्येक र्ार 1 धमिीिीटर क 9 धमिीिीटर में धमिाकर सीररयि धवियि 10⁻⁹ तक तैयार करें। (ङ) प्रत्येक धवियि से 0.1 धमिीिीटर क र ज़ र्ोंगाि अगर प्लेट पर स्प्रेि प्लेट करें, प्लेट्स क 28° से.

पर इिक्यूर्ेटर में रिें, प्रत्येक िाइल्यूशि के धिए तीि प्लेट्स (त्रैतीयक) र्िाए रिें, (च) पाोंच धदि र्ाद प्लेट्स का धिरीिण करें, मुिायम, ग्लैब्र स (र्ाि रधहत), यीस्ट जैसे, सफे द से क्ीम रोंग के कॉि िी की सोंख्या धगिें।10 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

38.4 संगणना- कॉि धिय ोंकी सोंख्या कॉि िी र्िािे वािी इकाई धवियि = (तीि पुिरावृधत्तय ोंका x x 10 (सीए़ियू प्रधत ग्राम) कारक औसत)

38.5 संदिम- जाधववस र्ी 1973 िाद्य पदार्ों में फफूों द ों और यीस्ट के चयिात्मक पृर्क्करण और सोंगणिा के धिए र्ेहतर र ज़ र्ोंगाि-क्ल रटेटरासाइक्तक्लि अगर की अन्य मीधिया के सार् तुििा, जिवि ऑफ र्ैक्टीररय िॉजी 36: 723- 727

39. यूजेनॉल का अवधारण.-

39.1 उपकरण- (क) जीसी-एफआईिी। (ख) वीए-5 एमएस के धपिरी कॉिम (30 मीटर x 0.25 धममी x 0.25 माइक् मीटर) से सुसक्तित जीसी-एमएस, (ग) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस

39.2 रसायन, गैस और अलिकर्मको ंकी तैयारी- (क) यूजेिॉि (सी.ए.एस. िों 97-53-0) (ख) हेक्सेि (सी.ए.एस. िों 110-54-3) (ग) िाइटर जि गैस (घ) एयर गैस (ङ) हाइिर जि गैस (च) मािक धवियि : 1.0 धमिी शीशी में मािक यूजेिॉि (1.0 धम.ग्रा.) िें और 1.0 धमिी हेक्सेि िािकर धमिाएों, (छ) िमूिा धवियि : 1.0 धमिीिीटर शीशी में िमूिा (1.0 धमिीग्राम) िें और 1.0 धमिीिीटर हेक्सेि िािें और धमिाएों।

39.3 प्रलिया- जीसी-एफआईडी स्थथलतयां : जीसी-एफआईडी स्थथलतयां लनम्न ताललका र्ें लनलदमष्ट हैं.- ताललका

(i) कॉिम के धपिरी कॉिम, एसएच आरटीएक्स-5 (30 मीटर× 0.25 धमिीमीटर×

0.25 माइक् मीटर)

(ii) वाहक गैस िाइटर जि

(iii) प्रवाह दर 1 धमिी/धमिट (क्तस्पिट म ि, 1:20)

(iv) इोंजेक्शि आयति 0.2माइक्रोलीटर

(v) इोंजेक्टर तापमाि 250oसे.

(vi) धिटेक्टर तापमाि 260°से.

(vii) ओवि तापमाि 60oसे. से 250oसे.

(viii) रैम्प प्र ग्राम 60oसे. और 3oसे./धमिट से 250oसे. पर क्तस्पिट म ि में प्र ग्राम करिा (1:20)[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 11

39.4 गणना- एफआईिी प्रधतधक्या कारक के धिए धर्िा सुिार कों प्यूटर द्वारा गणिा की गई जीसी पीक िेत्र ों (कवव के अिीि िेत्र अर्ावत, एयूसी) के आिार पर यूजेिॉि की सापेि मात्रा की गणिा करें, िमूिा पीक का एयूसी x मािक की साोंद्रता (धमिीग्राम/िीटर) x मािक की शुद्धता का % कु ि यूजेिाि%= िमूिा पीक का कु ि एयूसी x िमूिे की साोंद्रता (धमिीग्राम/िीटर)

39.5 संदिम - अधजत, एम., पोंकज, शकीि, एि.ए., कौधशक, पी., और राणा, वी.एस. सुगक्तित तेि ों और उिके प्रमुि यौधगक ों की मेि इि गाइि ग्रैधमधिक िा (चावि की जड़-गााँठ सूत्रकृ धम) के धवरुद्ध रासायधिक सोंरचिा और धिमेट साइिि धक्याशीिता। जिवि ऑफ एसेंधशयि ऑयि ररसचव 2020, 32, 526-535

40. फोललक एलसड (लवटालर्न र्बी9) का अवधारण -

40.1 उपकरण- (क) र्ाइिरी ग्रेधिएोंट पोंप के सार् एचपीएिसी (ि) ऐिाधिधटकि र्ैिेंस (ग) सेंटरीयूज (घ) माइक् धपपेट (100 -1000 माइक् िीटर, 20 -200 माइक् िीटर 10 -100 माइक् िीटर) (ङ) स धिके टर (च) व टेक्स धमक्सर (छ) ह म जेिाइज़र (ज) 0.45 माइक् मीटर िायिॉि धसररोंज ध़िल्टर

40.2 रसायन और अलिकर्मको ंकी तैयारी- (क) अम धियम हाइिरॉक्साइि (सी.ए.एस. ि. : 1336-21-6)। (ि) फॉस्फ ररक एधसि (सी.ए.एस. ि. : 7664-38-2)। (ग) म ि र्ेधसक प टेधशयम फॉस्फे ट (सी.ए.एस. ि. : 7778-77-0)। (घ) टेटराब्यूटाइि अम धियम हाइिरॉक्साइि (सी.ए.एस. ि. : 2052-49-5)। (ङ) मेर्िॉि (सी.ए.एस. ि. : 67-56-1)। (च) फ धिक एधसि (सी.ए.एस. ि. : 59-30-3)। (छ) जि (एचपीएिसी ग्रेि/अधत-शुद्ध जि)। (ज) 0.5एम टेटराब्यूटाइि अम धियम हाइिरॉक्साइि: 1000 धमिीिीटर मेर्िॉि में 129.735 ग्राम टेटराब्यूटाइि अम धियम हाइिरॉक्साइि घ िें। (झ) 3एि फॉस्फ ररक एधसि: 1000 धमिीिीटर फ्लास्क में 67.8 धमिीिीटर 85% फॉस्फ ररक एधसि िें, मात्रा 1000 धमिीिीटर तक करिे के धिए जि धमिाएाँ। (ञ) 6 एि अम धियम हाइिरॉक्साइि: 500 धमिीिीटर शुद्ध जि में 198 धमिीिीटर साोंद्र अम धियम हाइिरॉक्साइि (28% अम धियम हाइिरॉक्साइि, धवधशि गुरुत्व 0.90) धमिाएाँ और 1000 धमिीिीटर आयति तक तिु करें, (ट) म र्ाइि फे ज की तैयारी.-

(i) 1000 धमिी व ल्यूमेधटरक फ्लास्क में 2.0 ग्राम म ि र्ेधसक प टेधशयम फॉस्फे ट का सही-सही वजि करें और उसमें 650 धमिी जि धमिाएाँ;12 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

(ii) 15 धमिी 0.5एम टेटराब्यूटाइि अम धियम हाइिरॉक्साइि और 7.0 धमिी 3एि-फॉस्फ ररक एधसि धमिाएाँ;

(iii) 270 धमिी मेर्िॉि धमिाएाँ और इसे कमरे के तापमाि तक ठोंिा करें;

(iv) 3N-फॉस्फ ररक एधसि या 6 एि अम धियम हाइिरॉक्साइि के सार् पीएच 5.0 समाय धजत करें; और

(v) अोंत में अधत-शुद्ध जि से आयति क 1000 धमिी तक करें। (ठ ) िमूिा धवियि की तैयारी.-

(i) 1 ग्राम (± 0.1 ग्राम) नमूने का सटीक वजि िें और उसमें 0.1 धमिी 10% अम धियम हाइिरॉक्साइि धमिाएाँ और धफर उसे 10 धमिी एम्बर रोंग के वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में िािें, 5 धमिी म र्ाइि फे ज़ धमिाएाँ और पााँच धमिट तक व टेक्स में रिें

(ii) िमूिे के धवियि क कमरे के तापमाि पर ठोंिा करें;

(iii) द धमिट तक व टेक्स में रिें और म र्ाइि फे ज़ के सार् आयति क 10 धमिी तक र्िाएाँ;

(iv) धवियि क 0.45 माइक् मीटर िायिॉि धसररोंज धफल्टर से छाि िें; और

(v) धिथयोंद क शीशी में िािें और एचपीएिसी में इोंजेक्शि िगािे के धिए इसका उपय ग करें। धटप्पण : यधद आवश्यक ह , त िमूिे क वाोंधछत साोंद्रता तक तिु करें। (ि ) फ धिक एधसि के मािक स्टॉक धवियि की तैयारी.-

(i) 10 धमिी एम्बर रोंग के वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 10 धम.ग्रा. (± 0.1 धम.ग्रा.) फ धिक एधसि स्टैण्डिव का ठीक ढोंग से वजि करें और उसमें 0.1 धम.िी. 10% अम धियम हाइिरॉक्साइि धवियि धमिाएाँ और म र्ाइि फे ज से वॉल्यूम क 10 धम.िी. तक र्िाएाँ, द धमिट तक व टेक्स में घुमाएाँ, धवियि क -20°से. पर प्रकाश प्र टेक्टेि एररया में सोंग्रधहत करें, इससे 1000 धम.ग्रा./धक.ग्रा. का मािक स्टॉक धवियि (एसएसएस) प्राप्त ह ता है; और

(ii) िीचे दी गई ताधिका में धिधदवि धववरण के अिुसार कै िीब्रेशि मािक धवियि तैयार करें। ताललका ि. कैलीब्रेशन र्ानक र्ानक स्टॉक स्टैण्डडम फाइनल फाइनल सं. लवलयन लवलयन स्टॉक र्ेकअप कनसंन्ट्रेशन (लर्लीग्रार्/लकग्रा) लवलयन का आयतन (लर्लीग्रार्/लकग्रा) आयतन तानुकारक (लर्ली) (लर्ली)

(i) ि ीधियरटी धवियि 6 1000 1.50 10 150

(ii) ि ीधियरटी धवियि 5 1000 1.20 10 120

(iii) ि ीधियरटी धवियि 4 1000 1.00 10 100

(iv) ि ीधियरटी धवियि 3 1000 0.85 10 85

(v) ि ीधियरटी धवियि 2 1000 0.50 10 50

(vi) ि ीधियरटी धवियि 1 1000 0.20 10 20 लटप्पण : कैलीब्रेशन र्ानक लवलयन हर्ेशा नया तैयार करें।[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 13

40.3 प्रलिया- धिम्न ताधिका में धिधदवि क्तथर्धतय ोंका पािि करते हुए एचपीएिसी धवश्लेर्ण करें। ताललका

(i) उपकरण एचपीएिसी

(ii) धिटेक्टर यूवी

(iii) वेर्िैंर् 280 एिएम

(iv) कॉिम सी-18 ओिीएस कॉिम (4.6 धममी x 250 धममी x 5 माइक् मीटर)

(v) रि टाइम 10 धमिट

(vi) फ्ल रेट 1.8 धमिी/धमिट

(vii) इोंजेक्शि आयति 10 μl

(viii) कॉिम तापमाि 25°से. धटप्पण : उपकरण और कॉिम का मेक, मॉिि र्दिा जा सकता है, तर्ाधप उपकरण वाोंधछत जाोंच स्तर (एिओिी) और पररमाणीकरण स्तर (एिओक्यू) माि क प्राप्त करिे में सिम ह िा चाधहए और कॉिम कोंप ज़ीशि और िायमेंशि के सोंदभव में धर्ल्कुि समाि ह िा चाधहए।

40.4 गणना- धिम्नधिक्तित समीकरण का उपय ग करके प्रीधमक्स में फ धिक एधसि की गणिा करें- फ धिक एधसि (धवटाधमि र्ी9) िमूिा साोंद्रता (धमिीग्राम/धकग्रा) x मेक अप आयति (धमिीिीटर) = (धमिीग्राम / धकि ग्राम) िमूिे का वजि (ग्राम)

40.5 संदिम- मेर्ि प्र ट कॉि: पीआटी/आर/पीआरएम /2023/001, एचपीएिसी का उपय ग करके प्रीधमक्स में फ धिक एधसि (धवटाधमि र्ी9) के आकिि हेतु मेर्ि वैधििेशि ररप टव। यूिाइटेि स्टेट्स फामावक धपया- फ धिक एधसि (जाोंच)।

41. होर्ोब्रालसनोलाइड का अवधारण -

41.1 उपकरण- (क) ररवसव फे ज सी-18 कॉिम (150 धममी × 4.6 धममी x 3माइक् िीटर ) (ख) यूवी धिटेक्टर (ईएिएसिी) (ग) वेइोंग र्ैिेंस (घ) अल्टरास धिक र्ार् (ङ) र्मोस्टेट (च) 0.22माइक् ि धसररोंज ध़िल्टर

41.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी- (क) जि (अल्टरा-प्य र/एचपीएिसी ग्रेि) (ख) एसीट धिटराइि (सी.ए.एस. ि. 75-05-8) (ग) मेर्िॉि (सी.ए.एस. ि. 67-56-1) (घ) (22एस, 23एस)-28- ह म ब्राधसि िाइि (सी.ए.एस. ि. 82373-95-3) (ङ) फे धििर् र धिक एधसि14 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] (च) म र्ाइि फे ज की तैयारी: एसीट धिटराइि (80 धमिी) और जि (20 धमिी) क (80:20, वी/वी) के अिुपात में धमिाएाँ और पोंद्रह धमिट तक स धिके ट करें (छ) फे धििर् र धिक एधसि धवियि की तैयारी: िगभग 1500 धमिीग्राम (धिकटतम 0.01 ग्राम तक) फे धििर् र धिक एधसि क 250 धमिी के व ल्यूमेधटरक फ्लास्क में तौिें, मेर्िॉि के सार् धिशाि तक घ िें और अच्छी तरह धमिाएाँ। (ज) 28-ह म ब्राधसि िाइि स्टॉक स्टैण्डिव धवियि तैयार करिा:

(i) 25 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में 28-ह म ब्राधसि िाइि के 10 धमिीग्राम क सही ढोंग से तौिें और इसे घ ििे के धिए मेर्िॉि (15 धमिी) धमिाएाँ;

(ii) धफर 4 धमिी फे धििर् र धिक एधसि धवियि धमिाएाँ और इसे 50°से. पर र्मोस्टेट में तीस धमिट तक रिें;

(iii) धवियि क कमरे के तापमाि तक ठोंिा ह िे दें और मेर्िॉि से धिशाि तक भरें;

(iv) अच्छी तरह धमिाएाँ और फ्लास्क क पााँच धमिट के धिए अल्टरास धिक र्ार् में रिें, धफर धवश्लेर्ण से पहिे धवियि क 0.45 माइक् ि ध़िल्टर से छाि िें;

(v) इससे 400 धमिीग्राम/िीटर का स्टॉक मेम्ब्रेि धवियि प्राप्त ह ता है; और ताललका क्. सों. रैक्तिकता मािक स्टॉक धवियि उपय ग धकए उपय ग धकए कॉन्सेन्ट्रेशि का साोंद्रण जािे वािे जािे वािे मािक का (पीपीएम) स्टॉक घ ि की मेर्िॉि की (धमिीग्राम/ िीटर ) आयति आयति (एमएि) (एमएि)

(i) मािक 1 400 0.20 0.80 80

(ii) मािक 2 400 0.40 0.60 160

(iii) मािक 3 400 0.60 0.40 240

(iv) मािक 4 400 0.80 0.20 320

(v) मािक 5 400 1.00 0.00 400 (ञ) िमूिे की तैयारी.-

(i) िमूिा िेिे से पहिे उत्पाद क अच्छी तरह धमिाएाँ या धहिाएाँ;

(ii) 25 धमिी व िुमीधटरक फ्लास्क में 10 धमिीग्राम या 28- ह म ब्राधसि िाइि का 10 धमिीग्राम िाररत िमूिे की मात्रा िें;

(iii) घ ििे के धिए 15 धमिीिीटर मेर्िॉि धमिाएाँ;

(iv) 4 धमिी फे धििर् र धिक अम्ल धवियि धमिाएाँ और इसे 50°से. पर र्मोस्टेट में तीस धमिट तक रिें;

(v) धवियि क कमरे के तापमाि तक ठोंिा ह िे दें और मेर्िॉि से धिशाि तक भरें; और

(vi) अच्छी तरह धमिाएाँ और फ्लास्क क पााँच धमिट के धिए अल्टरास धिक र्ार् में रिें, धफर धवश्लेर्ण से पहिे धवियि क 0.45 माइक् ि ध़िल्टर मैम्बरेि से छाि िें।

41.3 प्रलिया.- िीचे दी गई ताधिका में धिधदवि क्तथर्तय ोंके अिुसार एचपीएिसी धवश्लेर्ण करें। ताललका

(i) क ॉिम सी18 (150 धममी x 4.6 धममी x 5 माइक् ि)

(ii) धि टेक्टर यूवी

(iii) धि टेक्तक्टोंग वेर्िेन्थ 220 एिएम[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 15

(iv) प्र वाह दर 1.0 धमिी/ धमिट

(v) क ॉिम तापमाि 25 0 सेक्तियस

(vi) म र्ाइि फे ज़ एसीट धिटराइि: वाटर (80: 20)

(vii) र ि टाइम 20 धमिट

(viii) इ ोंजेक्शि आयति 10 माइक्रोलीटर

41.4 गणना.- 28-ह म ब्राधसि िाइि मािक का द्रव्यमाि (धमिीग्राम) x 28-ह म ब्राधसि िाइि मािक की शुद्धता (ग्राम/धकग्रा) एफ = के िीब्रेशि धवियि में 28-ह म ब्राधसि िाइि पीक िेत्र 28-ह म ब्राधसि िाइि का िमूिा धवियि में 28-ह म ब्राधसि िाइि की पीक िेत्र x एफ = अोंश (ग्राम/धकग्रा) धिए गए िमूिे का द्रव्यमाि (धमिीग्राम)

41.5 संदिम.- सीआईपीएसी/5247/एम 28-ह म ब्राधसि िाइि (जूि 2020)।

42. प्रोटीन का अवधारण.- (क) कु ि िाइटर जि (िाइटरेट मुि िमूि ों में) अविारण के धिए अिुसूची-II के भाग ि में क्म सोंख्या 3 पर धदए गए धवस्तृत प्र ट कॉि का पािि करें; और (ख) अविाररत कु ि िाइटर जि से धिम्न सूत्र का उपय ग कर प्र टीि अविारण करें.- प्र टीि (%) = कु ि िाइटर जि x 6.25

43. एचपीएलसी द्वारा लवटालर्न-र्बी3 (लनयालसन) का अवधारण.-

43.1. उपकरण.- (क) फ्लूअरेसन्स धिटेक्टर के सार् एचपीएिसी प्रणािी। (ख) कॉिम - धिक् स्फीयर® 60 आर पी-18 (250 धममी x 4.0 धममी x 5 माइक् ि) (ग) 0.22 माइक् ि धसररोंज ध़िल्टर

43.2 रसायन और अलिकर्मक तैयार करना.- (क) स धियम एसीटेट, (ख) प टेधशयम िाइहाइिर जि फॉस्फे ट, (KH 2 PO 4 ), (ग) िॉि-स्टेधर्िाइज्ड हाइिर जि पेर क्साइि धवियि, H 2 O 2 (30%), (घ) कॉपर सल्फे ट, (ङ) एसीधटक अम्ल, (च) साोंद्र हाइिर क्ल ररक एधसि घ ि, (छ) स धियम हाइिरॉक्साइि, (ज) धिक धटधिक एधसि (सीएएस ि. 59-76-6), (झ) धिक धटिामाइि (सीएएस ि. 98-92-0), (ञ) जि (एचपीएिसी ग्रेि),16 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] (ट) 0.1एम हाइिर क्ल ररक एधसि घ ि: एक सूिा और साफ धकया हुआ 1000 धमिी वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क िें और उसमें 100 धमिी जि िािें, 8.3 धमिी साोंद्र हाइिर क्ल ररक एधसि िािें, जि के सार् धिशाि तक आयति तैयार करें और घ ि क अच्छी तरह से धमिाएों, (ठ) कॉपर सल्फे ट घ ि, [Cu(II)SO4.5H2O], यह म र्ाइि फे ज तैयार करिे हेतु तिुकरण के धिए उपयुि ह िा चाधहए। (ड) प टेधशयम िाइहाइिर जि फॉस्फे ट (KH 2 PO 4 ) धवियि , यह म र्ाइि फे ज तैयार करिे हेतु तिुकरण के धिए उपयुि ह िा चाधहए। (ढ) हाइिर जि पेर क्साइि धवियि (H 2 O 2 ), यह म र्ाइि फे ज तैयार करिे हेतु तिुकरण के धिए उपयुि ह िा चाधहए। (ण) 5एम स धियम हाइिरॉक्साइि धवियि: 20 ग्राम स धियम हाइिरॉक्साइि क 80 धमिीिीटर जि में घ िें, ठोंिा ह िे के र्ाद 100 धमिीिीटर तक पतिा करें। (त) धिक धटधिक एधसि स्टॉक धवियि (1 धमिीग्राम/धमिीिीटर) की तैयारी: धिक धटधिक एधसि मािक पदार्व (100 धमिीग्राम) क जि (100 धमिीिीटर) में घ िें, यह धवियि -18±1°से. पर एक सप्ताह तक क्तथर्र रहता है। (थ) धिक धटधिक एधसि (एिए) और धिक धटिामाइि (एिएएम) मािक धवियि (0.05 - 5 माइक् ग्राम /धमिी ): 100 धमिीिीटर जि में प्रत्येक स्टॉक धवियि के 1 धमिीिीटर के सार् पहिा धवियि तैयार करें, और इस धवियि से 100 धमिीिीटर जि में चार मािक धवियि (0.5 धमिीिीटर, 2.5 धमिीिीटर, 10 धमिीिीटर और 50 धमिीिीटर) तैयार करें, ये धवियि कमरे के तापमाि पर एक धदि के धिए क्तथर्र हैं। (द) िमूिा तैयार करिा:

(i) िमूिे (0.5- 2.0 ग्राम) क 25 धमिीिीटर 0.1एम हाइिर क्ल ररक एधसि के सार् व टेक्स पर धमिाएों;

(ii) ट्यूर् ोंक तैयार वाटरर्ार् में एक घोंटे तक गमव करें;

(iii) एक्स्ट्रैक्ट क एिेिमेयर फ्लास्क (250 एमएि) में थर्ािाोंतररत करें, और 20 धमिीिीटर धिक्तस्टल्ड जि और 4 धमिीिीटर 5एम स धियम हाइिरॉक्साइि धमिाएों, फ्लास्क क एक घोंटे के धिए 121± 1 °से. पर आट क्लेव करें;

(iv) ठोंिा करिे के पश्चात्, एक्स्ट्रैक्ट के पीएच क पहिे साोंधद्रत और धफर तिु 0.1एम हाइिर क्ल ररक एधसि के सार् 4.5 तक क्तथर्र करें; और

(v) धिक्तस्टल्ड जि के सार् एक्स्ट्रैक्ट क 100 धमिीिीटर तक तिु करें और एचपीएिसी शीधशय ोंमें ध़िल्टर करें।

43.3 प्रलिया.- (क) धियाधसि धवटाधमिसव (एिए और एिएएम) क िामवि फे ज धसधिका (एचएसएस) टी3 कॉिम (2.1 × 150 धममी, 1.8 माइक् ि) के सार् अिग करें। (ख) प टेधशयम फॉस्फे ट र्फर (प टेधशयम िाइहाइिर जि फॉस्फे ट के 70 धमिीएम; पीएच 4.5) में कॉपर सल्फे ट (CuSO , 5 माइक्रो एम) और हाइिर जि पेर क्साइि (H2O2, 150 धमिीएम) की 4 अिुकू धित साोंद्रता से युि म र्ाइि फे ज (0.3 धमिीिीटर/धमिट) के आइस क्े धटक प्रवाह का उपय ग करके 30 धिग्री सेक्तियस पर क् मैट ग्राधफक पृर्क्करण करें, (ग) कॉिम से धिकििे वािे इल्यूएोंट प्रवाह क एक धिटेि पीटीईई प्रधतधक्या कॉयि (1.59 धममी ओिी, 0.17 धममी आईिी और 5 मीटर िोंर्ाई) में िोंर्ी तरोंगदैध्यव यूवी प्रकाश (366 एिएम, 8 िब्ल्यू) के सोंपकव में िाएों, (घ) एिए और एिएएम का फ्ल र मेधटरक रूप से (322 एिएम एक्साइटेशि और 380 एिएम उत्सजवि तरोंगदैध्यव) पता िगायें, (ङ) िमूिा इक्स्ट्रैक्ट (10 माइक् िीटर) क द प्रधतय ोंमें इोंजेक्ट करें।[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 17 (च) एचपीएिसी क्तथर्धतय ोंका पािि धिम्न ताधिका में धिधदवि अिुसार करें– ताललका

(i) कॉिम िॉमवि फे ज धसधिका (एचएसएस) टी3 स्तोंभ (2.1 × 150 धममी, 1.8 माइक् मीटर)।

(ii) म र्ाइि फे ज़ म र्ाइि फे ज का आइस क्े धटक प्रवाह, धजसमें प टेधशयम फॉस्फे ट र्फर (70जमली एम प टेधशयम िाइहाइिर जि फॉस्फे ट, पीएच 4.5) में कॉपर सल्फे ट (5 माइक्रो एम CuSO ) और हाइिर जि 4 पेर क्साइि (150 जमली एम H O ) की अिुकू धित साोंद्रता सक्तिधित 2 2 है।

(iii) िमूिा इोंजेक्शि 10 माइक् िीटर.

(iv) ररटेंशि टाइम 3.6 धमिट (धिक धटधिक एधसि के धिए)।

10.6 धमिट (धिक धटिामाइि के धिए)। (ये कॉिम फे ज और धिमेन्शन्ज़ के सार्-सार् म र्ाइि फे ज प्रवाह दर के आिार पर धभन्न ह सकते हैं)।

(v) प्रवाह दर 0.3 धमिी/धमिट।

(vi) तापमाि 30 धिग्री सेक्तियस।

(vii) रि टाइम 15 धमिट। धटप्पण : धिक धटधिक एधसि (एिए) और धिक धटिामाइि (एिएिी) के धिए पता िगािे का स्तर क्मशः

0.02 एिजी और 0.01 एिजी है, धिक धटधिक एधसि और धिक धटिामाइि के धिए मात्रा का स्तर (पता िगािे के स्तर का 3 गुिा) क्मशः 0.06 एिजी और 0.03 एिजी है।

43.4 गणना.- धिक धटधिक एधसि और धिक धटिामाइि साोंद्रण की गणिा एक्सटिवि कै िीब्रेशि कवव (कै िीब्रेशि रेंज: 0.2 - 20 एिजी) का उपय ग करके की जािी चाधहए।

43.5 संदिम.- िाद्य पदार्ों में धियाधसि के धििावरण की धवधि, 2022 (एफएसएसएआई)।

44. कै रालर्बटोल (कै रागीनन ओललगोसेके राइड व्युत्पन्न) का अवधारण. -

44.1 उपकरण.- (क) एचपीएिसी क्ॉमधसि एिई पीर्ी + (8%) कॉिम (7.8 धममी x 300 धममी x 7µ) या यूएसपी एि34- आरपीएम म ि सैके राइि पीर्ी (+) कॉिम (ख) अपवतवक सूचकाोंक धिटेक्टर (ग) एिाधिधटकि र्ैिेंस (घ) अल्टरास धिक र्ार् (ङ) 0.22 माइक् ि धसररोंज धफल्टर

44.2 रसायन और अलिकर्मक.- (क) जि (एचपीएिसी ग्रेि) (ख) कै राधर्ट ि मािक18 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] (ग) कै राधर्टॉि मािक धवियि की तैयारी: 10 धमिीिीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में कै राधर्टॉि (0.01 ग्राम) तौिें और अोंधतम आयति एचपीएिसी ग्रेि जि के सार् तैयार करें और अच्छी तरह धमिाएाँ, (घ) धवियि क पोंद्रह धमिट तक अल्टरास धिके ट करें और 0.22 माइक् ि धसररोंज धफल्टर से छाि िें।

44.3 प्रलिया.- धिम्न ताधिका में धवधिधदवि क्तथर्धतय ोंके अिुसार एचपीएिसी धवश्लेर्ण करें, ताललका

(i) क ॉिम क् मधसि एिई पीर्ी+ (8%) कॉिम

(ii) ध िटेक्टर आरआई

(iii) ध िटेक्टर तापमाि 35±2 oसे.

(iv) प्र वाह दर 0.6 धमिी/धमिट

(v) क ॉिम तापमाि 80 ± 20 सेक्तियस

(vi) म र्ाइि फे ज़ जि(एचपीएिसी ग्रेि)

(vii) र ि टाइम 20 धमिट

(viii) इ ोंजेक्शि की मात्रा 10 माइक् िीटर

(ix) ट राई- कै राधर्ट ि (पीक 1) आरआरटी: 1.75

(x) ट ेटरा- कै राधर्ट ि (पीक 2) आरआरटी: 2.10

(xi) ह ेक्सा - कै रेधर्ट ि (पीक 3) आरआरटी: 2.25

(xii) ध ि- कै राधर्ट ि (पीक 4) ररटेंशि टाइम: 7-8 धमिट के र्ीच

44.4 गणना.- (क) िमूिे के धिए कै राधर्टॉि एररया (nRlU*s) = सभी चार पीक िेत्र का य ग ( पीक वि िेत्र + पीक 2 िेत्र + पीक 3 िेत्र + पीक 4 िेत्र); और (ख) मािक के धिए कै राधर्टॉि िेत्र % = सभी चार पीक िेत्र का य ग (पीक वि िेत्र + पीक 2 िेत्र + पीक 3 िेत्र + पीक 4 िेत्र)। िमूिा पीक िेत्र का औसत x मािक भार (ग्राम) x िाइल्यूशि कारक कु ि कै राधर्ट ि (%) = x मािक पीक िेत्र का औसत मािक पीक एररया का औसत x िमूिा भार (ग्राम)

44.5 संदिम.- एमपीटीिी/एचपीएिसी/2021/ई01 18 (सीएसआईआर - रािरीय अोंतः धवर्य धवज्ञाि और प्रौद्य धगकी सोंथर्ाि, माइक् धर्यि प्रधक्याएों और प्रौद्य धगकी प्रभाग)।

45. हालपमन -αβ का अवधारण.-

45.1. उपकरण.- (क) एचपीएिसी। (ख) अल्टरास धिक र्ार्। (ग) एिाधिधटकि र्ैिेंस (घ) िैब्रट री ग्लासवेयर।[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 19 (ङ) िीजर (-18°से.)।

45.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी.- (क) हाधपवि αβ (सीएएस सों. 917237-54-8) ज्ञात शुद्धता का मािक, (ख) एसीट धिटराइि, (ग) जि, (घ) टरीफ्लुओर असेधटक एधसि, (ङ) कै िीब्रेशि मािक स्टॉक धवियि: 10 धमिीग्राम हाधपवि αβ का वजि करें और 50 धमिीिीटर वॉल्यूमेधटरक फ्लास्क में िािें, म र्ाइि फे ज ए के सार् आयति क 50 धमिीिीटर तक करें, (च) म र्ाइि फे ज ए में िगभग 50-150 माइक् ग्राम/एमएि हाधपवि αβ पर कै िीब्रेशि मािक स्टॉक धवियि से कै िीब्रेशि धवियि तैयार करें, (छ) िमूिा धवियि: िगभग 1.0 ग्राम सैम्पि क म र्ाइि फे ज-ए (िगभग 100 माइक् ग्राम/एमएि हाधपवि αβ) के सार् 100 धमिीिीटर तक तिु करें।

45.3 िोर्ैटोग्रालफक पररस्थथलतयााँ.- क. धिम्न ताधिका में धवधिधदवि पररक्तथर्धतय ोंके अिुसार एचपीएिसी धवश्लेर्ण करें। ताललका

(i) कॉिम ज़ रर्ैक्स 300एसर्ी-सी8, 4.6 धममी x 50 धममी, 300 Ă, 5m यूएसजेके 001535. ( एक ज़ रर्ैक्स 300एसर्ी सी 8 5 pm, 4.6 धममी x 12.5 धममी गािव कॉटरेज कॉिम सधहत )।

(ii) धिटेक्शि वेर्िेंर् 218 एिएम.

(iii) म र्ाइि फे ज़ म र्ाइि फे ज -ए: 0.1% टराइफ्ल र एधसधटक एधसि + 99.9% वाटर (वी/वी)। म र्ाइि फे ज -र्ी: 0.1% टराइफ्ल र एसेधटक एधसि + 94.9% एसीट धिटराइि + 5% वाटर (वी/वी)।

(iv) सैम्पि इोंजेक्शि (20 माइक् िीटर )

(v) ररटेंशि टाइम 7.4 धमिट

(vi) प्रवाह दर 1.5 धमिी/धमिट

(vii) ताप 500से. ख. एचपीएिसी धवश्लेर्ण के दौराि धिम्न ताधिका में धवधिधदवि म र्ाइि फे ज ग्रेधिएन्ट् का अिुपािि धकया जािा चाधहए। ताललका क्. सों. समय (धमिट) म र्ाइि फे ज -र्ी का %

(i) 0.0 44

(ii) 5.0 54

(iii) 8.0 66

(iv) 8.5 100

(v) 9.5 100

(vi) 9.75 44

(vii) 12 44

45.4 गणना.- िमूिा िेत्र x मािक साोंद्रता x तिुकरण हाधपवि αβ (धमिीग्राम/धकि ग्राम) = मािक िेत्र x िमूिा वजि20 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

46. लैक्टोज का अवधारण.-

46.1 उपकरण.- (क) वाटर र्ार्, (ख) स्पेक्टर फ ट मीटर ।

46.2 रसायन और अलिकर्मक की तैयारी.- (क) धजोंक एसीटेट - फॉस्फ टोंगक्तस्टक एधसि (जेिएपीटी): 25.0 ग्राम धजोंक एसीटेट और 12.5 ग्राम फॉस्फ टोंगक्तस्टक एधसि क जि में घ िें, 20 धमिी ग्लेधशयि एधसधटक एधसि धमिाएों और 100 धमिी तक घ ि र्िाएों, (ख) ग्लाइधसि-NaOH र्फर: 2.4768 ग्राम ग्लाइधसि और 1.9359 ग्राम स धियम क्ल राइि युि 150 धमिीिीटर ग्लाइधसि घ ि क 850 धमिीिीटर 0.385 एि स धियम हाइिर क्साइि के सार् धमिाएों धजससे पीएच 12.8 ह जाए, (ग) धमर्ाइिऐमीि धवियि : धिक्तस्टि वाटर में 5.0 ग्राम धमर्ाइिऐमीि हाइिर क्ल राइि घ िें और 100 धमिीिीटर तक तिु करें तर्ा रेधिजरेटर में रिें, (घ) स धियम सल्फाइट धवियि 1% (िब्लू /वी ): आसुत जि में 1.0 ग्राम स धियम सल्फाइट घ िें और 100 धमिीिीटर तक तिु करें, ताजा तैयार करें, (ङ) 1एि स धियम हाइिर क्साइि धवियि: आसुत जि में 40 ग्राम स धियम हाइिर क्साइि घ िें और आयति एक िीटर करें, (च) मािक िैक्ट ज़ धवियि:

(i) स्टॉक धवियि: 2.5315 ग्राम िैक्ट ज़ म ि हाइिरेट (यूएसपी ग्रेि) क 200 धमिीिीटर 0.1 प्रधतशत (िब्लू /वी ) र्ेंज इक एधसि में घ िें और रेधिजरेटर में रिें; और

(ii) कायवशीि धवियि: 10, 15, 20, 25 और 30 धमिीिीटर स्टॉक धवियि क अिग-अिग 250 धमिीिीटर में तिु करें ताधक प्रधत धमिीिीटर 0.5 से 1.5 धमिीग्राम िैक्ट ज़ प्राप्त ह । (छ) िमूिे की तैयारी :

(i) 8.0 ग्राम अच्छी तरह धमधित िमूिे में 1 धमिी जेिएपीटी अधभकमवक धमिाएों, 10 धमिी तक तिु करें, और दस धमिट के र्ाद वॉटमैि िोंर्र 1 धफल्टर पेपर का उपय ग करके छाि िें; और

(ii) 0.5 धमिी धियोंद में 0.5 धमिी स धियम हाइिर क्साइि धवियि धमिाएों, 10 धमिी तक तिु करें और वॉटमैि िोंर्र 1 धफल्टर पेपर का उपय ग करके छाि िें, 5 धमिी धियोंद क 10 धमिी तक तिु करें।

46.3 प्रलिया.- (क) मािक वक् की तैयारी और िमूिे में माप : कायवशीि मािक िैक्ट ज और अज्ञात धवियि के 5 धमिीिीटर धपपेट क 25 धमिीिीटर टेस्ट ट्यूर् में िािें; (ख) प्रत्येक ट्यूर् में 5 धमिीिीटर ग्लाइसीि स धियम हाइिर क्साइि र्फर, 0.5 धमिीिीटर धमर्ाइिमाइि घ ि और 0.5 धमिीिीटर स धियम सल्फाइट घ ि िािें, अच्छी तरह धमिाएों;

(ग) ट्यूर् ों क र्मोस्टेधटक रूप से धियोंधत्रत वाटर र्ार् में 65 धिग्री सेक्तियस पर पच्चीस धमिट तक गमव करें और प्रधतधक्या क र किे के धिए तुरोंत द धमिट के धिए र्फव के वाटर र्ार् में ठोंिा करें;[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 21 (घ) स्पेक्टर फ ट मीटर या उपयुि स्पेक्टर फ ट मीटर में 540 एिएम पर ररि थर्ाि के धवरुद्ध अवश र्ण क पढें; और (ङ) िैक्ट ज की साोंद्रता के धवरुद्ध अवश र्ण क आिेक्तित करके एक मािक वक् र्िाएों और इससे िैक्ट ज की साोंद्रता धििावररत करें।

46.4 संदिम .- धिकसवि एट आि. 1976. िैक्ट ज़ और उसके हाइिर िाइधटक उत्पाद ों का किेरमेधटरक आकिि। जिवि िेयरी साइोंस 59, ि. 3, पृष्ठ 386।” [फा.सों. 3-5/2025-र्ाय क्तस्टमुिेंट्स] िैं कधिि एि ि र्ुोंग, सोंयुि सधचव लटप्पण : मूि आदेश भारत के राजपत्र में जीएसआर ि. 758(अ) तारीि 25 धसतोंर्र, 1985 द्वारा प्रकाधशत धकया गया र्ा और अोंधतम सोंस िि का. आ. 4441 (अ) तारीि 29 धसतम्बर, 2025 द्वारा धकया गया र्ा। MINISTRY OF AGRICULTURE AND FARMERS WELFARE (Department of Agriculture and Farmers Welfare)

ORDER New Delhi, the 30th September, 2025 S.O. 4533(E). – In exercise of the powers conferred by section 3 of the Essential Commodities Act, 1955 (10 of 1955), the Central Government hereby makes the following Order further to amend the Fertiliser (Inorganic, Organic or Mixed) (Control) Order, 1985, namely.-

1. (1) This Order may be called the Fertiliser (Inorganic, Organic or Mixed) (Control) Eleventh Amendment Order, 2025.

(2) It shall come into force on the date of its publication in the Official Gazette.

2. In the Fertiliser (Inorganic, Organic or Mixed) (Control) Order, 1985, in Schedule VI, in Part D “ METHODOLOGY OF TESTING” , after sub-heading 32, “Estimation of arsenic”, the following items and the entries shall be inserted, namely.- “33. Estimation of salicylic acid by HPLC.-

33.1 Equipment.-

(a) reverse phase C-18 column (250 mm×4.6 mm x 5µ).

(b) UV detector.

(c) analytical balance.

(d) 0.22µ syringe filter.

33.2 Chemicals and Reagent Preparations.-

(a) acetonitrile (HPLC grade, CAS No. 75-05-8).

(b) orthophosphoric acid (CAS No. 7664-38-2).22 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

(c) salicylic acid (CAS No. 69-72-7).

(d) water (HPLC grade).

(e) preparation of mobile phase: take acetonitrile and water (with 0.1% orthophosphoric acid) in the ratio of 50: 50 v/v, sonicate it for 5 minutes and vacuum filter the solution and degas before use.

(f) preparation of stock solution of salicylic acid standard: take salicylic acid (10 mg) in 10 ml volumetric flask, add 7 ml of mobile phase to the flask, sonicate for 10 minutes, make up the volume to 10 ml with mobile phase, it gives a stock solution of 1000 ppm.

(g) preparation of working solution of salicylic acid: dilute 1.0 ml stock standard to 10 ml with mobile phase and mix well, it gives working standard solution of 100 ppm, dilute 1.0 ml of working standard solution to 10 ml with mobile phase, it gives working standard solution of 10 ppm, prepare calibration curve as specified in table below.- Table S. No. Linearity Concentration Volume (ml) of Volume (ml) of Concentration of standard. of stock solution stock solution to water to be used. standard (µg/ml).

(ppm). be used.

(i) standard 1 10 ppm 0.10 0.90 1

(ii) standard 2 10 ppm 0.50 0.50 5

(iii) standard 3 10 ppm 1.0 0.00 10

(iv) standard 4 100 ppm 0.25 0.75 25

(v) standard 5 100 ppm 0.50 0.50 50

(vi) standard 6 100 ppm 1.0 0.00 100

(h) preparation of sample solution.-

(i) thoroughly mix or stir products prior to sampling;

(ii) for liquid products, accurately weigh 0.5 to 5 gram (±10%) of product into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(iii) for powdered products that do not require reconstitution, accurately weigh 1.0 gram powder into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(iv) add approximately 10 to 15 ml mobile phase to 50 ml volumetric flask and swirl or stir to completely dissolve the powder, for powdered products that are not homogeneous at the sub gram level, reconstitute following the product label instructions and accurately weigh 1.0 gram reconstituted product into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(v) make up the volume to 50 ml with mobile phase;

(vi) sonicate it for thirty minutes and filter it through 0.22µ syringe filter; and

(vii) inject 10µl to HPLC- UV system for analysis.

33.3 Procedure.- ` perform analysis following HPLC conditions as specified in table below.- Table

(i) Column C-18 (250 mm x 4.6 mm x 5 µ)

(ii) Detector UV

(iii) Detecting wavelength 237 nm

(iv) Flow rate 1.0 ml/ minute

(v) Column temperature 40oC

(vi) Mobile phase Isocratic elution with mobile phase using

acetonitrile: water (50: 50 v/v) with 0.1% orthophosphoric acid

(vii) Run time 50 minutes

(viii) Injection volume 10 µl

33.4 Calculation.- Sample area x Standard concentration x dilution Salicylic acid (mg/kg) = Standard area x Sample weight[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 23

33.5 Reference.- Kowalska M, Woźniak M, Kijek M, Mitrosz P, Szakiel J, Turek P. Management of validation of HPLC method for determination of acetylsalicylic acid impurities in a new pharmaceutical product. Scientific Reports 2022 Jan 6;12 (1):1.

34. Estimation of cytokinin by HPLC.-

34.1 Equipment.-

(a) reverse phase C-18 column (250 mm×4.6 mm x 5 µm).

(b) UV detector.

(c) analytical balance.

(d) 0.22µ syringe filter.

34.2 Chemicals and Reagents Preparation.-

(a) acetonitrile (HPLC grade, CAS No. 75-05-8).

(b) water (HPLC grade).

(c) methanol (HPLC grade, CAS No 67- 56-1).

(d) preparation of mobile phase.- solvent A - methanol: water: glacial acetic acid (50:450: l, v/v/v); and solvent B - methanol: glacial acetic acid (500: 1, v/v)

(e) preparation of stock solution of zeatin standard stock standard solution: take 10 mg zeatin in 10 ml volumetric flask. Add 1 ml of 0.1N NaOH and dissolve by sonication, make up the volume to 10 ml using methanol, it gives a stock solution of 1000 ppm.

(f) preparation of working solution of zeatin: dilute 1.0 ml stock standard to 10 ml with methanol and mix well, it gives an intermediate standard solution of 100 ppm, dilute 1.0 ml of intermediate standard solution to 10 ml with mobile phase, it gives an intermediate standard solution of 10 ppm, prepare calibration curve following details specified in table below.- Table S. Linearity Conc. of Stock Volume (ml) of Volume (ml) of Concentration of No. Standard solution (ppm) stock solution to methanol to be standard (µg/ml) be used used

(i) s tandard 1 10 ppm 0.50 0.50 5

(ii) s tandard 2 10 ppm 1.0 0.00 10

(iii) s tandard 3 100 ppm 0.5 0.50 50

(iv) S tandard 4 100 ppm 1.0 0.00 100

(v) s tandard 5 1000 ppm 0.2 0.80 200

(vi) s tandard 6 100 ppm 0.4 0.60 400

(g) preparation of sample solution.-

(i) thoroughly mix or stir products prior to sampling;

(ii) for liquid products, accurately weigh 0.5 to 5 gram (±10%) of product into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(iii) for powdered products that do not require reconstitution, accurately weigh 1.0 gram powder into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(iv) add approximately 10 to 15 ml mobile phase to 50 ml volumetric flask and swirl or stir to completely dissolve the powder, for powdered products that are not homogeneous at the sub gram level, reconstitute following the product label instructions and accurately weigh 1.0 gram reconstituted product into a 50 ml volumetric flask and record the weight to the nearest 0.0001 gram;

(v) sonicate it for thirty minutes and filter it through 0.22µ syringe filter; and

(vi) inject 10µl to HPLC-UV detector for analysis.

34.3 Procedure.-

(a) Initially condition the column with a solvent mixture of 80% of Solvent A and 20% of Solvent B, elute the compounds using solvent system given in HPLC conditions with a gradient elution of24 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)] increasing methanol concentration as zero to twenty minutes (20 % B+ 80 % A) to (45 % B+ 55 % A), twenty to twenty-two minutes (45 % B +55 % A), twenty-two to thirty minute (45 % B + 55 % A) to (60 % B + 40 % A), thirty to forty minute (60 % B to 40 % A); and

(b) HPLC conditions: perform HPLC analysis following HPLC operation conditions as specified in

table below:

Table

(i) column C18 (250 mm x 4.6mm x 5 µ)

(ii) detector UV

(iii) detecting wavelength 269 nm

(iv) flow rate 0.5 ml/ minute

(v) column temperature 30oC

(vi) mobile phase solvent A- Methanol: water: glacial acetic acid (50:450: l, v/v/v) solvent B- Methanol: glacial acetic acid (500: 1, v/v)

(vii) run time 40 minutes

(viii) injection volume 20µl

34.4 Calculation.- sample area x standard concentration x dilution Cytokinin (mg/kg) = standard area x sample weight

34.5 Reference.- Qi, B.;Wu, C.; Liang, H.; Cui, K.; Fahad, S.; Wang, M.; Liu, B.; Nie, L.; Huang, J.; Tang, H.

Optimized High-Performance Liquid Chromatography Method for Determining Nine Cytokinins, Indole-3-acetic Acid and Abscisic Acid. Sustainability 2021, 13, 6998.

35. Estimation of carbohydrate or saccharides.-

35.1 Equipment.-

(a) spectrophotometer.

(b) vortex mixer.

(c) heating mantle/water bath.

(d) weighing balance.

35.2 Chemicals and Reagents Preparation.-

(a) anthrone (CAS No. 90-44-8).

(b) concentrated HCl (CAS No. 7647-01-0).

(c) concentrated H SO (CAS No. 7664-93-9).

2 4

(d) 2.5N HCl: take 208.3 ml of concentrated HCl and make up the volume to 1000 ml with water.

(e) anthrone reagent: dissolve 200mg anthrone in 100ml of ice cold concentrated H SO , prepare 2 4 fresh before use.

(f) stock standard glucose: dissolve 100mg glucose in 100ml water, it gives a stock of 1000 mg/ml glucose solution.

(g) working standard: dilute 10ml of stock solution to 100ml with distilled water, it gives a working standard of 100 mg/ml, store refrigerated after adding a few drops of toluene.

Note: cool the contents of all the tubes on ice before adding ice-cold anthrone reagent.

35.3 Procedure.-

(a) weigh 100mg of the sample into a boiling tube;

(b) hydrolyze by keeping it in boiling water bath for 3 hours with 5ml of 2.5N HCl and cool to room temperature;

(c) neutralize it with solid sodium carbonate until the effervescence ceases;[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 25

(d) make up the volume to 100ml and centrifuge;

(e) collect the supernatant and take 0.5ml and 1ml aliquots for analysis;

(f) prepare the standards by taking 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1ml of the working standard, ‘0’ serves as blank;

(g) make up the volume to 1ml in all the tubes including the sample tubes by adding distilled water;

(h) add 4ml of ice cold anthrone reagent;

(i) heat for eight minutes in a boiling water bath;

(j) cool rapidly on ice and read the green to dark green color at 630nm;

(k) draw a standard graph by plotting concentration of the standard on the X-axis versus absorbance on the Y-axis; and

(l) from the graph calculate the amount of carbohydrate present in the sample tube.

35.4 Calculation.- Amount of carbohydrate = (mg of glucose ÷ volume of test sample) x 100 (in 100mg sample)

35.5 Reference.- Hedge, JE and Hofreiter BT (1962) In: Carbohydrate Chemistry 17 (Eds Whistler R L and Be Miller, J N) Academic Press New York.

36. Estimation of starch.-

36.1 Equipment.-

(a) water bath.

(b) high speed centrifuge.

(c) Spectrophotometer.

(d) analytical balance.

36.2 Chemicals and Reagents preparation.-

(a) ethanol 95%- to 95 ml of absolute ethanol add 5 ml of water.

(b) concentrated Perchloric acid.

(c) concentrated H SO 2 4.

36.3 Procedure.-

(a) homogenize 0.1 to 0.5gram of the sample in hot 80% ethanol to remove sugars, centrifuge and retain the residue, wash the residue repeatedly with hot 80% ethanol till the washing do not give color with anthrone reagent, dry the residue well over a water bath;

(b) to the residue add 5.0ml of water and 6.5ml of 52% perchloric acid;

(c) extract at 0°C for 20minutes, centrifuge and save the supernatant;

(d) repeat the extraction using fresh perchloric acid, centrifuge and pool the supernatant and make up to 100ml;

(e) pipette out 0.1ml or 0.2ml of the supernatant and make up the volume to 1 ml with water; and

(f) proceed for analysis of reducing sugars using anthrone reagent as detailed in protocol for estimation of carbohydrate or saccharides by anthrone method at Serial No. 35.

36.4 Calculation.- Find out the glucose content in the sample using the standard graph, multiply the value by a factor 0.9 to arrive at the starch content.

36.5 Reference.- Hodge JE and Hofreiter BT 1962. In: Methods in Carbohydrate Chemistry (eds Whistler RL and Be Miller JN) Academic Press New York.

37. Estimation of cellulase activity.-

37.1 Equipment.-26 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

(a) spectrophotometer.

(b) water-bath.

(c) analytical balance.

37.2 Chemicals and Reagents preparation.-

(a) carboxy methyl cellulose (CAS No. 9004-32-4).

(b) dinitrosalicyclic acid (CAS No. 609-99-4).

(c) phenol (CAS No. 108-95-2).

(d) sodium sulfite (CAS No. 7757-83-7).

(e) rochelle salt (Potassium sodium tartarate)(CAS No. 6381-59-5).

(f) citric acid monohydrate (CAS No. 5949-29-1).

(g) citrate buffer: dissolve citric acid monohydrate (210gram) in 750 ml distilled water, adjust the pH to 4.3 using NaOH, make up the volume to 1000 ml and add NaOH to adjust the pH to 4.5 and this gives 1M Citrate buffer (pH 4.5), now take 5 ml of 1 M Citrate buffer, add 90 ml of distilled water and adjust the pH to 4.8 using NaOH and make up the volume to 100 ml with distilled water, this gives a solution of 0.05M Citrate buffer (pH 4.8).

(h) dinitrosalicylic acid (DNSA) stock solution: it comprises of solution A and solution B as given below.-

(i) solution A: dissolve 10 gram of NaOH in 1000 ml of water, mix well to dissolve and it will give 1% NaOH solution; and

(ii) solution B: to solution A, add 200 mg of K-Na tartarate, 2 gram of crystalline phenol and 10gram of DNS, place the beaker on a heater/stirrer and warm gently, whilst stirring, to dissolve, cool to ambient temperature and store the solution in amber coloured bottles at 4oC.

(i) DNSA working solution: to 99 ml of stock DNSA, add 1 ml of 5% sodium sulfite and mix well to dissolve;

(j) substrate preparation: weigh 2gram of carboxymethyl cellulose (CMC) and dissolve it in 100 ml of

0.05M citrate buffer (pH 4.8), stir the mixture vigorously to promote dissolution and if necessary, heat the solution to a moderate temperature (e.g., 60°C) to facilitate dissolution;

(k) standard stock solution of glucose: dissolve 100mg glucose in 100ml water and it gives a stock of 1mg/ml;

(l) working standard solution of glucose: pipette out aliquots from 0.1 ml to 1 ml in a clean dry test tube, make up the volume to 1 ml with 0.05 M citrate buffer (pH 4.8) and prepare blank by taking 1 ml 0.05 M citrate buffer (pH 4.8);and

(m) preparation of sample solution: thoroughly mix or stir products prior to sampling, for liquid products, take 1 ml of the sample and dilute with 0.05M citrate buffer (pH 4.8) and use the dilution factor for calculation, and for powdered products, take 1 gram of sample and dissolve it in 10ml of

0.05M citrate buffer (pH 4.8) and take 1 ml of the sample for testing.

37.3 Procedure.-

(a) take 1 ml of the test sample, blank and glucose working standards in the test tubes and incubate for thirty minutes in water bath maintained at 50oC;

(b) add 3 ml of DNSA reagent and incubate the test tubes for fifteen minutes in a boiling water bath; and

(c) cool the samples and read the absorbance at 575 nm in spectrophotometer.

37.4 Calculation.-

(a) prepare a standard curve of glucose and calibrate for estimation of reducing sugars in the sample; and

(b) express the enzyme activity as IU/ml using the equation.- CMCase activity= mg glucose released x 0.37 x DF (if any)

37.5 Reference.- Ghose TK 1987. Measurement of cellulase activities. Pure and Applied Chemistry 59: 257-268.[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 27

38. Enumeration of Wickerhamo mycesanomolus.-

38.1 Equipments.-

(a) analytical balance.

(b) pH meter.

(c) autoclave.

(d) biosafety cabinet or laminar air flow chamber.

(e) incubators.

(f) colony counter.

38.2 Preparation of growth medium and diluents.-

(a) growth medium: prepare Rose Bengal agar medium as per the composition specified in table below.- Table S. No. Constituents gram per liter

(i) dextrose 10

(ii) peptone 5

(iii) mono potassium phospahte 1

(iv) magnesium sulphate 0.5

(v) rose Bengal 0.05

(vi) agar 18

(vii) pH 7.2+ 0.2

(b) autoclave prepared media at 121oC for fifteen minutes and after autoclaving add 10 ml of filter sterilized chlorotetracycline or chloramphenicol (1% w/v).

(c) Diluent: Physiological saline (0.9% sodium chloride) - Add 0.9 gram of NaCl to 100 ml of water.

38.3 Procedure.-

(a) prepare the Rose Bengal medium in accordance with the composition and procedure described in Sl No. 38.2 above and let the medium cool to 45-50oC;

(b) pour about 15- 20 ml of medium into petri plates in a laminar flow bench;

(c) dispense 10gram of test sample to 90 ml of autoclaved physiological saline in 250 ml conical flask and shake for thirty minutes on shaker at 150 rpm and this gives 10-1dilution of the sample;

(d) prepare nine tubes each containing physiological saline and autoclave and cool it;

(e) transfer 1 ml of aliquot from 10-1 dilution to a tube with 9 ml of physiological saline, this gives 10-2diltuion and likewise, make serial dilutions up to 10-9 each time transferring 1 ml to 9 ml of physiological saline;

(f) spread plate 0.1 ml of serially diluted sample on rose Bengal agar plate and incubate the plates in an incubator maintained at 28oC and for each dilution, maintain plates in triplicate; and

(g) observe the plates for growth after five days, count the number of colonies that are smooth, glabrous (without hairs), yeast like, white to cream coloured.

38.4 Calculation.- Colony forming unit (CFU per number of colonies = x dilution factor x 10 gram) (mean of three replicates)

38.5 Reference.- Jarvis B 1973. Comparison of an improved rose bengal-chlortetracycline agar with other media for the selective isolation and enumeration of moulds and yeasts in foods, Journal of Bacteriology 36:

723- 727

39. Estimation of Eugenol.-

39.1 Equipment.-

(a) GC-FID.

(b) GC-MS equipped with a VA-5 MS capillary columns (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm).

(c) weighing balance.28 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

39.2 Chemicals, Gas and Reagents preparation.-

(a) eugenol (CAS No. 97-53-0).

(b) hexane (CAS No. 110-54-3).

(c) nitrogen gas.

(d) air gas.

(e) hydrogen gas.

(f) standard solution: take standard eugenol (1.0mg) in 1.0 ml vial and add 1.0ml hexane and mix.

(g) sample solution: take sample (1.0mg) in 1.0 ml vial and add 1.0ml hexane and mix.

39.3 Procedure.- GC-FID Conditions: GC-FID conditions are specified in table below.- Table

(i) C olumn Capillary column, SH Rtx-5 (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm)

(ii) C arrier gas Nitrogen

(iii) F low-rate 1 ml/minute (split mode, 1:20)

(iv) In jection volume 0.2µl

(v) In jector temperature 250oC

(vi) D etector temperature 260°C

(vii) O ven temperature 60oC to 250oC

(viii) R amp programe 60oC and programmed at 3oC/minute to 250oC with split mode (1:20)

39.4 Calculation.- Calculate the relative amount of eugenol based on computer calculated GC peak areas (Area under Curve i.e., AUC) without corrections for FID response factor.

AUC of the sample peak x concentration of standard (mg/L) x % purity of Total Eugenol % = standard Total AUC of standard peak x concentration of sample (mg/L)

39.5 Reference.- Ajith, M., Pankaj, Shakil, N.A., Kaushik, P., and Rana, V.S. Chemical composition and nematicidal activity of essential oils and their major compounds against Meloidogyne graminicola (Rice Root-Knot Nematode). Journal of Essential Oil Research 2020, 32, 526-535.

40. Determination of Folic acid (Vitamin B9).-

40.1 Equipment.-

(a) HPLC with binary gradient pump.

(b) analytical balance.

(c) centrifuge.

(d) micropipettes (100 -1000 μl, 20 -200 μl 10 -100 μl).

(e) sonicator.

(f) vortex mixer.

(g) homogenizer.

(h) 0.45μm nylon syringe filter.

40.2 Chemicals and Reagents Preparation.-

(a) ammonium hydroxide (CAS No: 1336-21-6).

(b) phosphoric acid (CAS No: 7664-38-2).

(c) monobasic potassium phosphate (CAS No: 7778-77-0).

(d) tetrabutylammonium hydroxide (CAS No: 2052-49-5).

(e) methanol (CAS No 67- 56-1).

(f) folic Acid (CAS No: 59-30-3).

(g) water (HPLC grade/ultra-pure water).[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 29

(h) 0.5M tetra butyl ammonium hydroxide: dissolve 129.735 gram of tetra butyl ammonium hydroxide in 1000 ml methanol.

(i) 3N phosphoric acid: take 67.8 ml of 85% phosphoric acid in a 1000 ml flask, add water to make up the volume to 1000 ml.

(j) 6N ammonium hydroxide: add 198 ml of concentrated ammonium hydroxide (28% NH OH, 4 specific gravity 0.90) to 500 ml of purified water and dilute to 1000 ml volume.

(k) Preparation of mobile phase.-

(i) accurately weigh 2.0 gram of monobasic potassium phosphate into a 1000 ml volumetric flask and add 650 mL of water to it;

(ii) add 15 ml of 0.5M tetra butyl ammonium hydroxide and 7.0 ml of 3-N-phosphoric acid;

(iii) add 270 ml of methanol and cool it to room temperature;

(iv) adjust pH 5.0 with 3 N-phosphoric acid or 6-N-ammonium hydroxide; and

(v) finally make the volume to 1000 ml with ultra-pure water.

(l) Preparation of sample solution.-

(i) accurately weigh 1 gram (± 0.1 gram) and add 0.1 ml of 10 % ammonium hydroxide and then transfer into a 10 ml amber colored volumetric flask, add 5 ml mobile phase and vortex for five minutes;

(ii) cool the sample solution at room temperature;

(iii) make up the volume to 10 ml with mobile phase and vortex for two minutes;

(iv) filter the solution through 0.45μm nylon syringe filter; and

(v) pour the filtrate into the vial, and use it for injecting into HPLC.

Note: If required, dilute the sample for desired concentration.

(m) Preparation of standard stock solution of folic acid.-

(i) accurately weigh 10 mg (± 0.1 mg) of folic acid standard in 10 ml amber coloured volumetric flask and add 0.1 ml of 10% ammonium hydroxide solution and make up the volume to 10 ml with mobile phase, vortex for two minutes, store the solution at -20°C in the light protected area, it gives a standard stock solution (SSS) of 1000 mg/kg; and

(ii) prepare calibration standard solutions as per the details specified in the table below.- Table S. No. calibration Standard Stock volume of final make up final standard Solution (mg/kg) Standard Stock volume diluent concentration solutions Solution (ml) (ml) (mg/kg)

(i) Linearity 1000 1.50 10 150 Solution 6

(ii) Linearity 1000 1.20 10 120 Solution 5

(iii) Linearity 1000 1.00 10 100 Solution 4

(iv) Linearity 1000 0.85 10 85 Solution 3

(v) Linearity 1000 0.50 10 50 Solution 2

(vi) Linearity 1000 0.20 10 20 Solution 1

Note: Always make fresh preparation of calibration standard solutions.

40.3 Procedure.- Perform HPLC analysis following HPLC Conditions as specified in table below.- Table

(i) Instrument HPLC

(ii) Detector UV

(iii) Wavelength 280 nm30 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

(iv) Column C-18 ODS Column (4.6 mm X 250 mm X 5 μm)

(v) Run time 10 minutes

(vi) Flow rate 1.8 ml/minute

(vii) Injection Volume 10 μl

(viii) Column Temperature 25°C

Note: The make, model of Instrument & Column can be changed, however instrument should be able to achieve the desired Level of Detection (LOD) and Level of Quantification(LOQ) Value & the Column is exactly same in terms of the composition and dimensions.

40.4 Calculations.- Calculate the folic acid content in premix using the following equation.- Sample concentration (mg/kg) x make up volume (ml) Folic Acid (Vitamin B9) (mg/kg) = Sample weight (gram)

40.5 Reference.-

Method protocol: PRT/RA/PRM/2023/001, method validation report for estimation of folic acid (Vitamin B9) in premix using HPLC. United States Pharmacopeia- Folic acid (assay).

41. Estimation of homobrassinolide.-

41.1 Equipment.-

(a) reverse phase C -18 column (150 mm×4.6 mm x 3µm).

(b) UV detector (ELSD).

(c) weighing balance.

(d) ultrasonic bath.

(e) thermostat.

(f) 0.22µ syringe filter.

41.2 Chemicals and Reagents preparation.-

(a) water (Ultra-pure/HPLC grade).

(b) acetonitrile (CAS No. 75-05-8).

(c) methanol (CAS No 67- 56-1).

(d) (22S, 23S)- 28- homobrassinolide (CAS No 82373-95-3).

(e) phenylboronic acid.

(f) preparation of mobile phase: mix Acetonitrile (80ml) and water (20ml) in a ratio of (80:20, v/v) and sonicate for fifteen minutes.

(g) preparation of phenylboronic acid solution: weigh approximately 1500mg (to the nearest 0.01gram) phenylboronic acid into 250ml volumetric flask, dissolve to the mark with methanol and mix thoroughly.

(h) preparation of 28-Homobrassinolide stock standard solution:

(i) weigh accurately 10 mg of 28 Homobrassinolide in 25 ml volumetric flask and add methanol (15 ml) to dissolve it;

(ii) add 4ml phenylboronic acid solution and keep it for thirty minutes in thermostat at 50°C;

(iii) allow the solution to cool to ambient temperature and fill to the mark with methanol;

(iv) mix thoroughly and place the flask in an ultrasonic bath for five minutes, then filter the solution through a 0.45μm filter membrane prior to analysis;

(v) it gives a stock solution of 400 mg/liter; and

(i) prepare linearity point as specified in table below.- Table S. No. Linearity Standard concentration volume (ml) volume (ml) of concentration of of stock of stock methanol to be standard (mg/litre) solution (ppm) solution to be used used

(i) standard 1 400 0.20 0.80 80

(ii) standard 2 400 0.40 0.60 160

(iii) standard 3 400 0.60 0.40 240[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 31

(iv) standard 4 400 0.80 0.20 320

(v) standard 5 400 1.00 0.00 400

(j) Preparation of sample preparation.-

(i) thoroughly mix or stir products prior to sampling;

(ii) weigh 10 mg or sufficient sample to contain about 10mg of 28-Homobrassinolide into 25ml volumetric flask;

(iii) add 15ml of methanol to dissolve;

(iv) add 4ml phenylboronic acid solution and keep it for thirty minutes in thermostat at 50°C;

(v) allow the solution to cool to ambient temperature and fill to the mark with methanol; and

(vi) mix thoroughly and place the flask in an ultrasonic bath for five minutes, then filter the solution through a 0.45μm filter membrane prior to analysis.

41.3 Procedure.- Perform HPLC analysis following conditions as specified in table below.- Table

(i) Column C18 (150 mm x 4.6mm x 5 µ)

(ii) Detector UV

(iii) Detecting wavelength 220 nm

(iv) Flow rate 1.0 ml/ minute

(v) Column temperature 25oC

(vi) Mobile phase acetonitrile: water (80: 20)

(vii) Run time 20 minutes

(viii) Injection volume 10 µl

41.4 Calculation.- mass of 28-Homobrassinolide standard (mg) x purity of 28-Homobrassinolide standard (g/kg) f = peak areas of 28-Homobrassinolide in the calibration solution peak areas of 28-Homobrassinolide in the sample solution x f Content of 28-Homobrassinolide (g/kg) = mass of sample taken (mg)

41.5 Reference.- CIPAC/5247/m 28-Homobrassinolide (June 2020).

42. Estimation of protein.-

(a) follow protocol detailed at Part B of Schedule II at Serial No. 3 for estimation of total nitrogen (in nitrate free samples); and

(b) total nitrogen estimated to be used for estimation of protein using the formula.- Protein (%) = total nitrogen x 6.25

43. Estimation of vitamin-B3 (niacin).-

43.1. Equipment.-

(a) HPLC system with fluorescence detector.

(b) column - LiChrospher® 60 RP-18 (250 mm x 4.0 mm x 5 µm).

(c) 0.22µm syringe filter

43.2 Chemicals and Reagents preparation.-

(a) sodium acetate.

(b) potassium dihydrogen phosphate, KH PO .

2 4

(c) non stabilized hydrogen peroxide solution, H O (30%).

2 232 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

(d) copper sulfate.

(e) acetic acid.

(f) concentrated hydrochloric acid solution.

(g) sodium hydroxide.

(h) nicotinic acid (CAS No 59-76-6).

(i) nicotinamide (CAS No 98- 92-0).

(j) water (HPLC grade).

(k) 0.1M hydrochloric acid solution: take a dried and cleaned 1000 ml volumetric flask and add 100 ml of water, add 8.3 ml of concentrated hydrochloric acid, make up the volume up to the mark with water and mix the solution thoroughly.

(l) copper sulfate solution, [Cu(II)SO4.5H2O], it should be suitable for dilution to prepare mobile phase.

(m) potassium dihydrogen phosphate (KH PO ) solution, it should be suitable for dilution to prepare 2 4 mobile phase.

(n) hydrogen peroxide solution (H O ), it should be suitable for dilution to prepare mobile phase.

2 2

(o) 5M sodium hydroxide solution: dissolve 20 gram of sodium hydroxide in 80ml of water, after cooling dilute to 100 ml.

(p) preparation of nicotinic acid stock solution (1 mg/ml): dissolve nicotinic acid standard substance (100 mg) in water (100 ml), this solution is stable for one week at -18±1°C).

(q) nicotinic acid(NA) and nicotinamide(NAM) standard solutions (0.05 - 5 μg/ml): prepare first solution with 1 ml of each stock solution in 100 ml of water, and from this solution prepare four standard solutions (0.5 ml, 2.5 ml, 10 ml and 50 ml) in 100 ml of water, these solutions are stable for one day at room temperature.

(r) sample preparation:

(i) vortex the sample (0.5- 2.0 gram) with 25 ml of 0.1M hydrochloric acid;

(ii) heat the tubes for one hour in a boiling water bath;

(iii) transfer the extracts into erlenmeyer flasks (250 mL), and add 20 ml of distilled H O and 4 ml 2 of 5M sodium hydroxide, autoclave the flasks at 121± 1 °C for one hour;

(iv) after cooling, adjust the pH of the extracts to 4.5 first with concentrated and then with dilute

0.1M hydrochloric acid; and

(v) dilute the extracts to achieve 100 ml with distilled H O and filter into HPLC vials.

2

43.3 Procedure.-

(a) separate the niacin vitamers (NA and NAM) with a normal phase silica (HSS) T3 column (2.1 × 150 mm, 1.8 μm).

(b) perform the chromatographic separation at 30°C using an isocratic flow of the mobile phase (0.3 ml/minute) consisting of an optimized concentration of copper sulphate (CuSO , 5 μM) and 4 hydrogen peroxide (H O , 150 mM) in a potassium phosphate buffer (70 mM of potassium 2 2 dihydrogen phosphate; pH 4.5).

(c) expose the eluent flow from the column to a long-wavelength UV light (366 nm, 8 W) in a knitted PTEE reaction coil (1.59 mm o.d., 0.17 mm i.d. and 5 m length).

(d) detect NA and NAM fluorometrically (322 nm excitation and 380 nm emission wavelengths).

(e) inject the sample extracts (10 μl) in duplicate.

(f) HPLC Conditions to be followed as specified in table below.- Table

(i) column normal phase silica (HSS) T3 column (2.1 × 150 mm, 1.8 μm).

(ii) mobile phase isocratic flow of the mobile phase, consisting of an optimized concentration of copper sulphate (5μM CuSO ) and hydrogen 4 peroxide (150mM H O ) in a potassium phosphate buffer (70mM 2 2 potassium dihydrogen phosphate, pH 4.5).

(iii) sample injection 10 μl.

(iv) retention time 3.6 minutes (for nicotinic acid).

10.6 minutes (for nicotinamide). (These may vary depending on the column phase and dimensions as well as mobile phase flow rate).

(v) flow rate 0.3 ml/minute.[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 33

(vi) temperature 30°C.

(vii) run time 15 minutes.

Note: The level of detection for nicotinic acid and nicotinamide is 0.02 ng and 0.01 ng respectively, the level of quantification (3-fold the level of detection) for nicotinic acid and nicotinamide is 0.06 ng and

0.03 ng respectively.

43.4 Calculation.- The nicotinic acid and nicotinamide concentrations to be calculated using external calibration curves (calibration range: 0.2 - 20 ng).

43.5 Reference.- Method for Determination of Niacin in foodstuffs, 2022 (FSSAI).

44. Method of analysis of Carrabiitol (Carrageenan oligosaccharide derivatives).-

44.1 Equipment.-

(a) HPLC CromSil LE PB + (8%) column (7.8 mm x 300 mm x 7µ) or USP L34- RPM monosaccharide PB (+) column.

(b) refractive index detector.

(c) analytical balance.

(d) ultrasonic bath.

(e) 0.22μ syringe filter.

44.2 Chemicals and Reagents.-

(a) water (HPLC grade).

(b) carrabiitol standard.

(c) preparation of carrabiitol standard solution: weigh carrabiitol (0.01 g) in a 10ml volumetric flask and make up the final volume with HPLC grade water and mix well.

(d) ultrasonicate solution for fifteen minutes and filter with 0.22µ syringe filter.

44.3 Procedure.- Perform HPLC analysis following conditions as specified in table below.- Table

(i) Column CromSil LE PB+ (8%) column

(ii) Detector RI

(iii) Detector temperature 35±2oC

(iv) Flow rate 0.6 ml/minute

(v) Column temperature 80+2oC

(vi) Mobile phase Water (HPLC grade)

(vii) Run time 20 minutes

(viii) Injection volume 10 µl

(ix) Tri- Carrabiitol (Peak 1) RRT: 1.75

(x) Tetra- Carrabiitol (Peak 2) RRT: 2.10

(xi) Hexa- Carrabiitol (Peak 3) RRT: 2.25

(xii) Di- Carrabiitol (Peak 4) Retention time: between 7- 8 minute

44.4 Calculation.-

(a) Carrabiitol Area (nRlU*s) for sample = Sum of all four peak Area (Peak 1 Area + Peak 2 Area + Peak 3 Area + Peak 4 Area); and

(b) Carrabiitol Area % for standard = Sum of all four peak Area (Peak 1 Area + Peak 2 Area + Peak 3 Area + Peak 4 Area).

Total Carrabiitol (%) = Average of Sample peak area x Standard. weight (g) x Dilution factor x Average of standard peak area Average of Standard peak area x Sample weight (gram)34 THE GAZETTE OF INDIA : EXTRAORDINARY [PART II—SEC. 3(ii)]

44.5 Reference.- MPTD/HPLC/2021/E01 18 (CSIR – National Institute for Interdisciplinary Science and Technology, Microbial Processes and Technology Division).

45. Determination of Harpin-αβ.-

45.1. Equipment.-

(a) HPLC.

(b) ultrasonic Bath.

(c) analytical balances.

(d) laboratory glassware.

(e) freezer (-18°C).

45.2 Chemicals and Reagents preparation.-

(a) harpin αβ (CAS No. 917237-54-8) standard of known purity.

(b) acetonitrile.

(c) water.

(d) trifluoroacetic acid.

(e) calibration standard stock solutions: weigh 10 mg of harpin αβ and add to 50 ml volumetric flask, make the volume to 50 ml with mobile phase A.

(f) prepare the calibration solutions from calibration standard stock solution over approximately 50- 150 µg/ml Harpin αβ in mobile phase A.

(g) sample solutions: approximately 1.0 gram sample to be diluted to 100 ml with mobile phase A (approximately 100 µg/ml Harpin αβ).

45.3 Chromatographic Conditions.-

(a) Perform HPLC analysis following conditions as specified in table below.- Table

(i) column Zorbax 300SB-C8, 4.6 mm x 50 mm, 300 Ă, 5m USJK001535. (including a Zorbax 300SB C8 5 pm, 4.6 mm x 12.5 mm guard cartridge column).

(ii) detection wavelength 218 nm.

(iii) mobile phase Mobile Phase A: 0.1% trifluoroacetic acid + 99.9% water (v/v).

Mobile Phase B: 0.1% trifluoroacetic acid + 94.9% acetonitrile + 5% water (v/v).

(iv) sample injection (20 μL).

(v) retention time 7.4 minutes.

(vi) flow rate 1.5 ml/minute.

(vii) temperature 50oC.

(b). mobile phase gradient as specified in table below to be followed during HPLC analysis.- Table S. No. Time (Minutes) % of Mobile Phase-B

(i) 0.0 44

(ii) 5.0 54

(iii) 8.0 66

(iv) 8.5 100

(v) 9.5 100

(vi) 9.75 44

(vii) 12 44

45.4 Calculation.- sample area x standard concentration x dilution Harpin αβ (mg/kilogram) = standard area x sample weight[भाग II—खण् ड 3(ii)] भारत का रािपत्र : असाधारण 35

46. Determination of lactose.-

46.1 Equipment.-

(a) water bath.

(b) spectrophotometer.

46.2 Chemicals and Reagents Preparation.-

(a) Zinc Acetate - Phosphotungstic acid (ZAPT): dissolve 25.0 gram of zinc acetate and 12.5 gram of Phosphotungstic acid in water, 20 ml of glacial acetic acid is added and made up to 100 ml.

(b) Glycine-NaOH buffer: mix 150 ml of glycine solution containing 2.4768 gram of glycine and

1.9359 gram NaCl with 850 ml of 0.385 N NaOH to give pH of 12.8.

(c) Methylamine solution: dissolve 5.0 gram of methylamine HCl in distilled water and dilute to 100 ml and store in refrigerator.

(d) Sodium Sulphite solution 1% (w/v): dissolve 1.0 gram of sodium sulphite in distilled water and dilute to 100 ml, prepare fresh.

(e) 1N NaOH solution: dissolve 40 gram of NaOH in distilled water and make the volume to one litre.

(f) Standard Lactose solution:

(i) stock solution: dissolve 2.5315 gram of lactose monohydrate (USP grade) in 200 ml of 0.1 percent (W/V) benzoic acid and store in refrigerator; and

(ii) working solution: dilute 10, 15, 20, 25 and 30 ml of stock solution to 250 ml separately to get 0.5 to 1.5 mg of lactose per ml.

(g) Preparation of sample:

(i) to 8.0 gram of well mixed sample add 1 ml of ZAPT reagent, dilute to 10 ml, and after ten minutes filter using Whatman No. 1 filter paper; and

(ii) to 0.5 ml of the filtrate add 0.5 ml of NaOH solution, dilute to 10 ml and filter using Whatman No. 1 filter paper, dilute 5 ml of the filtrate to 10 ml.

46.3 Procedure.-

(a) preparation of standard curve and measurement in sample: Pipette 5 ml each of working standard lactose and unknown solution into 25 ml test tubes;

(b) add 5 ml of glycine NaOH buffer, 0.5 ml of methylamine solution and 0.5 ml of sodium sulphite solution in each tube, mix thoroughly;

(c) heat tubes in a thermostatically controlled water bath at 65°C for twenty five minutes and cool immediately in an ice water bath for two minutes to stop the reaction;

(d) read absorbance against blank at 540 nm in a spectrophotometer or a suitable spectrophotometer; and

(e) draw a standard curve by plotting absorbance against concentration of lactose and determine the concentration of lactose from it.

46.4 Reference.- Nickerson et al. 1976. Colorimetric estimation of lactose and its hydrolytic products. Journal Dairy Science 59, No 3, page 386”. [F.No. 3-5/2025-Biostimulants] FRANKLIN L. KHOBUNG, Jt. Secy.

Note: The principal Order was published in the Gazette of India vide G.S.R. number 758(E), dated the 25th September, 1985 and was last amended vide S.O. dated 4441(E) dated 29th September, 2025.

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